Avaliação da ação de fixadores alternativos ao formol - Finefix e RCL-2 PDF

Preview

Summary

Trabalho sobre experiência realizada. Contém informação teorica acerca do tema....

Description

Avaliação da ação de fixadores alternativos ao formol: Finefix e RCL -2

Índice Introdução ..............................................................................................................................1 Material ..................................................................................................................................3 Métodos .................................................................................................................................4 Resultados .............................................................................................................................5 Discussão/Conclusão .............................................................................................................9 Referências bibliográficas ....................................................................................................11 Anexos ....................................................................................................................................I

Índice de figuras Figura 1 – Fragmentos após a fixação. A- RCL2; B- Formol; C-FineFIX.................................5 Figura 2 – Fragmentos após o processamento. A- RCL2; B- Formol; C- FineFIX. ..................5

i

Figura 3 – Fragmentos após inclusão. A- FineFIX; B- Formol; C- RCL2 .................................6 Figura 4 – Lâminas coradas pela coloração de HE. A- FineFIX; B- Formol; C- RCL2.............6 Figura 5 – Corte de fragmento fixado por formol. Ampliação 100x. A- Lâmina corada pelo professor; B- Lâmina corada pelos alunos..............................................................................6 Figura 6 – Corte de fragmento fixado por RCL2. Ampliação 100x. A- Lâmina corada pelo professor; B- Lâmina corada pelos alunos..............................................................................7 Figura 7 – Corte de fragmento fixado por FineFIX. Ampliação 100x. A- Lâmina corada pelo professor; B- Lâmina corada pelos alunos..............................................................................7 Figura 8 – Áreas de calcificação do pulmão. Lâminas coradas pelo professor. Ampliação 100x. A- Lâmina fixada por FineFIX; B- Lâmina fixada por Formol; C- Lâmina fixada por RCL2 ......7 Figura 9 – Áreas de calcificação do pulmão. Lâminas coradas pelos alunos. Ampliação 100x. A- Lâmina fixada por Formol; B- Lâmina fixada por RCL2; C- Lâmina fixada por FineFIX ......8

ii

Introdução Num laboratório de histopatologia, até ser possível observar as suas estruturas ao microscópio, uma amostra tem de passar por diversas etapas. A fixação dos tecidos é muito importante para o exame histológico, uma vez que, os fixadores atuam de forma a endurecer e preservar os tecidos e evitar a perda de moléculas específicas. Ou seja, retardam fenómenos de degradação celular, preservando as estruturas morfológicas o mais próximo do estado “in vivo”. (1) Assim, a fixação é extremamente importante para que os tecidos se encontrem resistentes aos estudos e técnicas que poderão ser sujeitos posteriormente. (2) A fixação pode usar fatores físicos, como a congelação, ou substâncias químicas, que formam reações com sítios específicos ou inespecíficos de biomoléculas impedindo alteração tecidual. Porém, para além de vantagens, cada fixador apresenta desvantagens, tais como perda molecular, endurecimento, aumento ou retração dos tecidos durante o processo e variações na qualidade da coloração histoquímica e imuno-histoquímica. (1) Desta forma, um bom fixador tem de obedecer a certas caraterísticas: não deformar os tecidos por turgescência ou plasmólise, permitir boa adesão dos corantes, impedir alterações de forma e volume durante as diferentes etapas, apresentar baixo nível de toxicidade, entre outras. (3) O fixador de eleição da histologia é o formol a 10%. As suas pequenas moléculas permitem uma rápida penetração nos tecidos, permitindo uma elevada velocidade de fixação. (1) O formaldeído reage com os tecidos e dá origem a ligações covalentes entre macromoléculas, o que confere estabilidade. No entanto, o formol, ainda que seja o fixador de rotina utilizado na histologia, é muito tóxico e está classificado como carcinogénico, estando associado a patologias do trato respiratório e alergias. (4) Apesar de o formol ser um bom fixador, um vez que mantém a estrutura e arquitetura morfológica e celular dos tecidos, ele altera os ácidos nucleicos. (5) Assim, uma outra desvantagem deste fixador é o facto de se ligar ao DNA e RNA de tal forma agressiva, que impedem a extração do material genético para eventuais estudos moleculares. (4) Os dois fixadores alternativos ao formol em estudo, têm uma base de etanol em comum. O RCL2 apresenta etanol (70%) e ácido acético na sua composição, sendo que o etanol aumenta a taxa de difusão da mistura fixadora nos tecidos e células, e o ácido acético impede a retração significativa dos tecidos, conferida pelo etanol. (6) Estudos comprovam que este fixador alternativo fornece uma boa morfologia e produz bons resultados em estudos de imunohistoquímica, assim como preserva a estrutura do RNA. Este fixador encontra-se desprovido de toxicidade, pelo que poderá ser uma boa alternativa ao formol, uma vez que técnicos que o usarão não se encontrarão expostos a reagentes carcinogénicos, como é o caso do formol. (7) FineFIX é uma mistura de etanol, água destilada, glicerol, álcool polivinílico e carboidratos monoméricos. (6) É um fixador que não contém formol e por isso apresenta uma baixa toxicidade e outras vantagens, como a preservação da morfologia do núcleo e do citoplasma. A concentração de etanol na mistura do fixador é de cerca de 70%, concentração que permite uma boa histologia dos tecidos. Este fixador apresenta várias vantagens, como a extração de tecido gordo enquanto a peça se encontra submersa, apresenta uma cor mais real quando comparada com a cor que as amostras possuem quando fixadas em formol, entre outras. O FineFIX pode ainda reduzir o tempo de processamento, uma vez que durante a fixação já ocorre uma desidratação dos tecidos e pode ser utilizado como um pós-fixador pela sua capacidade de remover gorduras. (3)

1

Esta atividade laboratorial tem, então, como objetivo avaliar os efeitos de dois fixadores alternativos ao fixador de eleição, uma vez que o formol apresenta várias desvantagens, referidas acima. Desta forma, pretende-se perceber se estes são bons substitutos do formol, verificando se permitem obter resultados semelhantes aos deste fixador. Adquirir conhecimentos sobre o tratamento das amostras e utilização das diferentes técnicas do processamento das mesmas é também um dos objetivos, bem como colaborar na preparação dos fixadores alternativos. Em acréscimo, vem a melhoria do desenvolvimento de trabalho em equipa, essencial nos laboratórios da área de anatomia patológica.

2

Material Material Cassetes Moldes Bisturis Pinças Lâminas Lamelas Tábua Lápis Pincel Carretes para coloração das lâminas Recipiente com água fria Recipiente com água quente (banho maria) Meio de montagem sintético 3 fragmentos de uma amostra de pulmão de tecido autopsiado

Equipamentos Estufa Hotte Microscópio ótico Micrótomo Aparelho de inclusão Processador em carrossel

Reagentes Formaldeído (4%) RCL2 FineFIX Etanol Xilol Parafina Corantes (coloração Hematoxilina-Eosina)

3

Métodos Durante todo o trabalho foram usadas várias técnicas com diferentes metodologias.

1. Preparação dos fixadores Para a preparação do FineFIX juntou-se 72mL de etanol absoluto e 28mL da solução de FineFIX comercial. Para a preparação do formol, juntou-se 50 mL de formaldeído a 40% e 450mL de água. Finalmente, para a preparação do RCL2, 62,5mL de etanol absoluto e 37,5mL da solução comercial de RCL2.

2. Macroscopia Foi feita uma disseção de pulmão e escolheram-se três fragmentos com dimensões semelhantes entre si. Estes fragmentos foram descritos com base nas suas características físicas e colocados em cassetes. Em três frascos foram colocados os diferentes fixadores de forma a terem todos o mesmo volume, e colocada a respetiva cassete com o fragmento. Passada uma semana foi feita uma nova descrição das características dos fragmentos.

3. Processamento Foram colocadas as cassetes no processador e o processamento foi realizado overnight. (Ver anexo I). Após o processamento, foi feita uma nova descrição das caraterísticas dos fragmentos.

4. Inclusão Os fragmentos foram, de seguida, incluídos em parafina, de acordo com as regras e técnicas adequadas. Após serem incluídos todos os fragmentos, foram colocados na placa de refrigeração e, posteriormente, os blocos de parafina foram desenformados e, se necessário, a parafina em excesso à volta da cassete foi raspada.

5. Microtomia Começou-se por desbastar os blocos obtidos na inclusão, seguindo-se o corte dos mesmos. Os cortes foram feitos a 3µm e foi possível a obtenção de ténias e, posteriormente, os cortes histológicos obtidos foram colocados em água fria, selecionando-se nesta etapa o melhor corte, que é depois estendido em banho maria. Os cortes histológicos foram deixados na estufa overnight.

6. Coloração e montagem Foi realizada a coloração de Hematoxilina-Eosina nos cortes obtidos (Ver anexo II). Por fim, as lâminas foram montadas e observadas ao microscópio, com o registo das características observadas.

4

Resultados A

C

B

Figura 1 – Fragmentos após a fixação. A- RCL2; B- Formol; C-FineFIX. Após uma semana de os fragmentos terem sido fixados, foi feita uma avaliação comparativa. Foi possível verificar que todos os fragmentos escureceram e endureceram. Contudo, estas alterações foram mais ligeiras no fragmento fixado em formol e mais acentuadas no fragmento fixado em RCL2. Neste último, foi possível notar um endurecimento heterogéneo, ou seja, umas partes mais endurecidas do que outras. Relativamente às alterações de volume, os fragmentos fixados em RCL2 e em FineFIX sofreram uma maior alteração do que o fragmento fixado em formol. Para além disso, antes da fixação, o tecido encontrava-se com um aspeto mais ensanguentado. A

B

C

Figura 2 – Fragmentos após o processamento. A- RCL2; B- Formol; C- FineFIX. Após o processamento os tecidos encontravam-se ainda mais endurecidos e, quando comparados uns com os outros, o fragmento fixado em formol era o que apresentava menor rigidez e o FineFIX o que apresentava maior.

5

A

B

C

Figura 3 – Fragmentos após inclusão. A- FineFIX; B- Formol; C- RCL2. A

B

C

Figura 4 – Lâminas coradas pela coloração de HE. A- FineFIX; B- Formol; C- RCL2. A

B

Figura 5 – Corte de fragmento fixado por formol. Ampliação 100x. A- Lâmina corada pelo professor; B- Lâmina corada pelos alunos.

6

A

B

Figura 6 – Corte de fragmento fixado por RCL2. Ampliação 100x. A- Lâmina corada pelo professor; B- Lâmina corada pelos alunos.

A

B

Figura 7 – Corte de fragmento fixado por FineFIX. Ampliação 100x. A- Lâmina corada pelo professor; B- Lâmina corada pelos alunos. Podemos observar uma melhor coloração nas lâminas coradas pelo professor comparativamente à coloração apresentada nos cortes das lâminas coradas pelos alunos. Também pode-se ver que, tanto nas lâminas coradas pelo professor como nas coradas pelos alunos, o corte do fragmento fixado em formol apresenta uma coloração mais clara, enquanto que o RCL2 apresenta uma coloração mais intensa.

A

B

C

Figura 8 – Áreas de calcificação do pulmão. Lâminas coradas pelo professor. Ampliação 100x. A- Lâmina fixada por FineFIX; B- Lâmina fixada por Formol; C- Lâmina fixada por RCL2.

7

A

B

C

Figura 9 – Áreas de calcificação do pulmão. Lâminas coradas pelos alunos. Ampliação 100x. A- Lâmina fixada por Formol; B- Lâmina fixada por RCL2; C- Lâmina fixada por FineFIX.

8

Discussão/Conclusão O principal objetivo inicial deste trabalho foi comparar o desempenho de fixadores alternativos ao formol a 10%, nomeadamente FineFIX e RCL2, nas técnicas de diagnóstico usadas em laboratórios de anatomia patológica. Durante a microtomia, o desbaste tem como objetivo retirar toda a parafina em excesso de modo a que o fragmento fique à superfície da cassete. Após serem feitos os cortes, eles são colocados em água fria para que as pregas desapareceram e, por vezes, isto pode ser feito com a ajuda de, por exemplo, um lápis não com a ponta muito afiada, fazendo pressão nas pregas. Por vezes, também se pode adicionar etanol à água fria para diminuir a tensão superficial e facilitar a extensão do corte. Após os cortes estarem um pouco na água fria, são colocados em banho maria para que a extensão seja concluída. É importante não colocar mais do que uma amostra no mesmo banho para não haver a possibilidade de troca de amostras. As lâminas foram colocadas na estufa para permitir uma melhor adesão dos cortes às lâminas, não sendo possível a sua remoção nas etapas seguintes. A rigidez excessiva dos tecidos provocada pelo FineFIX e pelo RCL2 pode ser explicada tendo em conta a composição dos fixadores, uma vez que estes têm como base o etanol que desidrata o tecido, podendo levar ao seu endurecimento excessivo. Assim sendo, e tendo em conta a manutenção das caraterísticas físicas e mais próximas do estado “in vivo” do tecido, podemos destacar o formol como sendo o melhor fixador. Na coloração efetuada com hematoxilina-eosina e posterior visualização microscópica, verificou-se que a coloração efetuada nas aulas estava notoriamente mais clara que a dada pelo professor. Uma vez que os corantes utilizados numa e noutra coloração não foram os mesmos, esta coloração mais clara pode ter sido devido aos corantes e diferentes reagentes utilizados durante o processo estarem saturados e não estarem nas suas devidas condições para utilização e obtenção de uma boa coloração. Também se verificou que a utilização dos fixadores alternativos apresentou uma aparente melhoria no detalhe nuclear, bem como uma maior intensidade e um melhor contraste da coloração comparativamente à utilização de formol a 10%. Isto pode dever-se à diferente afinidade do corante pelos componentes dos diferentes fixadores. Também, no que diz respeito às áreas de calcificação do pulmão (Figuras 8 e 9), é possível visualizar um melhor contraste nas lâminas coradas pelo professor. É de realçar que o processamento dos tecidos foi feito tendo em conta os tempos necessários para o formol. Por este motivo, os fixadores alternativos podem não ter tido os melhores resultados, uma vez que o processamento não foi adaptado aos diferentes fixadores. O mesmo aconteceu com a coloração por HE, sendo que esta estava adaptada à fixação por formol. No que diz respeito aos cortes dos três fragmentos, podemos observar que o formol permitiu uma fácil obtenção de ténias, enquanto que o FineFIX foi o fixador em que foi mais difícil a obtenção destas, pois os cortes apresentavam numerosas pregas. Em conclusão, apesar de o formol ter sido o fixador que provocou menor alteração física nos tecidos, verificamos que tanto o FineFIX como o RCL2 podem ser usados como fixadores alternativos ao formol, uma vez que, com estes fixadores obtivemos resultados satisfatórios e semelhantes aos resultados obtidos com a fixação em formol, no que diz respeito à observação microscópica dos cortes. Contudo, entre o FineFIX e o RCL2, é importante realçar a maior facilidade na obtenção de bons cortes e a existência de uma melhor qualidade na coloração, apresentando um melhor detalhe nuclear, nos fragmentos fixados em RCL2. Posto isto, pode ser feita uma otimização destes fixadores alternativos, que pode impedir alguns problemas, tais como a rigidez excessiva dos tecidos. Por estes motivos e pelo 9

facto de o formol apresentar diversas desvantagens no que diz respeito à saúde dos técnicos que se encontram expostos a este reagente, o que não acontece com os fixadores alternativos em estudo, então é possível afirmar que o FineFIX e o RCL2 são dois possíveis fixadores substitutos do formol.

10

Referências bibliográficas 1.

Suvarna SK, Layton C, Bancroft JD. Bancroft’s Theory and Practice of Histological techniques. 7a. Churchill Livingstone; 2012.

2.

Timm LDL. Técnicas Rotineiras De Preparação E Análise De Lâminas Histológicas. Cad La Salle XI. 2005;2(1):231–9.

3.

Formalin NEW, Fixative F, Morphology FORO, Analysis M. NEW FORMALIN - FREE FIXATIVE FOR OPTIMAL MORPHOLOGY AND MOLECULAR ANALYSIS FineFIX The advantages of form.

4.

Arrays T, Slide V. RCL2 ® , Formalin-free tissue fixative.

5.

Bellet V, Boissière F, Bibeau F, Desmetz C, Berthe ML, Rochaix P, et al. Proteomic analysis of RCL2 paraffin-embedded tissues Western-blot. J Cell Mol Med. 2008;12(5B):2027–36.

6.

Silva D, Carvalho C, Scigliano H, Fernandes S, Silva R. FineFIX®: fixador alcoólico alternativo para a prática citológica? 2010;1–7. Available from: http://recipp.ipp.pt/handle/10400.22/1414

7.

Delfour C, Roger P, Bret C, Berthe ML, Rochaix P, Kalfa N, et al. RCL2, a new fixative, preserves morphology and nucleic acid integrity in paraffin-embedded breast carcinoma and microdissected breast tumor cells. J Mol Diagnostics. 2006;8(2):157– 6

11...