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BACTERIAS INTRACELULARES

Las bacterias intracelulares pueden introducirse en neutrófilos, monocitos/macrófagos o fagocitos no profesionales (célula endotelial, fibroblasto,...). La probabilidad de que se introduzcan en unas u otras depende de que haya en el entorno fagocitos profesionales (en sangre hay sobretodo neutrófilos). Si la bacteria se introduce en neutrófilos, se producirá su eliminación. En el caso de monocitos/macrófagos puede producirse o no la eliminación. Si no son capaces de eliminar la bacteria que tienen dentro, actúan otras células para eliminar la célula infectada: citotoxicidad celular por NK, CTLs αβ y γδ.

Las bacterias intracelulares tienen la capacidad para sobrevivir y multiplicarse en el interior de células e incluso de los fagocitos profesionales. Entran por diversas vías: aire, sangre, alimentos. Son poco tóxicas, y las células infectadas sobreviven. Son casi inaccesibles a los anticuerpos, buscan la fagocitosis, resisten el ataque del fagocito pero sucumben ante los macrófagos activados por linfocitos Th1 (IFNg). La incubación es larga y la enfermedad persistente (enconamiento de la respuesta provoca daños).

Las bacterias intracelulares buscan hábitat y refugio en nuestras células por lo que es necesaria una respuesta contras las células infectadas. Provocan reacciones granulomatosas. La formación de granulomas depende de células fagocíticas (macrófagos), CTL y células CD4 proinflamatorias (Th1 productores de IFNg) que las estimulan. La protección inmune se debe a anticuerpos opsonizadores y células T y b memoria antígeno específicas.

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EVOLUCIÓN DE INFECCIONES INTRACELULARES La incubación suele ser larga. El sistema inmune puede abortar la infección antes de que produzca enfermedad o eliminarle completamente. Lo más frecuente es que se produzca un equilibrio entre la proliferación del patógeno y su eliminación que resulta en infección crónica. La enfermedad la causa la interacción entre el SI y el patógeno. La toxicidad y lesión se debe principalmente a la respuesta inmunitaria del huésped. -

Si las células eliminan al patógeno: sin enfermedad clínica. Si contienen al patógeno y lo confinan: superan la enfermedad clínica (el equilibrio puede perderse). No confinan pero contiene la enfermedad clínica. Permanente infectan a otros. Ni confinan ni contienen: la enfermedad clínica mata al huésped.

TIPOS DE BACTERIAS INTRACELULARES Podemos hablar de bacterias facultativas y obligadas. FACULTATIVAS Ej.: Mycobacterium, Salmoella, Brucella, Legionella,Listeria, Francisella. Infectan fagocitos mononucleares pero también a otras células. Tienen estrategias de supervivencia intracelular, pero pueden vivir fuera.

OBLIGADAS Ej.: Rickettsia y Chlamidiae No sobreviven fuera de células y prefieren fagocitos no profesionales, como las células endoteliales. Tienen moléculas de invasión que les facilitan entran en fagocitos no profesionales en los que les es más fácil sobrevivir.

INMUNIDAD FRENTE A ABACTERIAS INTRACLEULARES Son inaccesibles a anticuerpos y complemento, y resistentes a fagocitos ordinarios. Se eliminan por inmunidad celular dependiente de células T: respuestas de TCD4 y macrófagos son muy importantes; también respuestas de CTL de tipo TCRαβ y TCRγδ.

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Los antígenos son presentados en MHC II a células Th que activan fagocitos y en MHCI y CD1 a CTL, CD8 y DN, que lisan células infectadas.

CARACTERISTICAS PATOGENICIDAD Características esenciales -

Estilo de vida intracelular. Las células T interaccionan con células infectadas no directamente con los microbios. Sistemas de presentación antigénica de glucolípidos y péptidos intracelulares. Estas infecciones estimulan hipersensibilidad de tipo retardado (IV) por linfocitos T y macrófagos (respuesta Th1). Provocan reacciones tisulares granulomatosas, cuya ruptura disemina las bacterias.

Características condicionales: - No son directamente tóxicas y la patología resulta de la reacción inmune. - Las bacterias intracelulares coexisten con sus hábitat celulares durante largos periodos, no los destruyen.

MODELOS DE INFECCIÓN INTRACELULAR  Tuberculosis crónica Produce cada año 8 millones de nuevos casos, 2 millones de muertes, 2000 millones de infectados (90% aparentemente sanos, 10% desarrollan enfermedad). M. tuberculosis es un bacilo aerobio obligado que prefiere tejidos con alta presión de oxigeno. Desde aerosoles, infecta pulmones y puede diseminarse a otros tejidos. Son reconocidos por células T no convencionales. Incubación larga, infección durmiente (persisten en granulomas) es una patología de larga duración. El sistema inmune intenta contener la infección pero si se debilita el patógeno se multiplica y disemina. *Modelo animal infección con M bovis de hámster dorado.

Los glicolípidos de Mycobacterium les hacen resistentes pero estimulan el SI innato. Contienen abundantes glicolípidos que les hacen resistentes al complemento y a pH extremos. Son reconocidos por el SI innato y hacen de el Mycobacterium un buen adyuvante en inmunización (Adyuvante completo de Freund aceite/agua + BCG) Calmette y Guerin desarrollaron una cepa atenuada de M bovis llamada Baccillus CalmetteGuerin (BCG) que se usa como adyuvante en inmunización y como vacuna frente a la tuberculosis.

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*Adyuvante. Secuestra el material antigénico y lo lleva a los fagocitos a los que estimula para que inicien la activación de células T antígeno- específicas. Protocolo e inmunización primero con adyuvante completo después dosis de recuerdo con adyuvante incompleto (sin BCG).

Vacuna BCG Cepa atenuada de M. bovis llamada Baccillus Calmette-Guerin (BCG) que es utilizada como una vacuna viable: previene la tuberculosis miliar en niños, evita diseminación hematógena en primoinfección que produciría innumerables nódulos en pulmones y otros tejidos. No protege de modo completo contra la tuberculosis pulmonar en los adultos.

 Listeriosis Ejemplo de infección intracelular aguda con respuesta Th1, escape lisosomal, e infección citoplásmica. L. monocytogenes es un anaerobio facultativo gram+ que afecta al ganado y raramente a los humanos. Para investigar se usa un modelo experimental en ratón. Entre los factores de virulencia encontramos la listeriolisina que promueve el escape desde el fagosoma al citoplasma. Sobrevive en macrófagos en reposo pero es eliminada rápidamente en los activados por IFNγ. Provoca una infección aguda que termina tras la activación de los linfocitos Th1 que producen IFNγ y la activación de los macrófagos infectados.

 Salmonelosis Se producen 16 millones de nuevos casos al año, 600.000 muertes. -

S. enterica incluye unas 2000 serovariedades. S. enterica typhi restringida a humanos. S. enterica typhimurium en ratón (modelo animal).

Se transmite a través de comida provocando diarrea. Pueden atravesar pared intestinal y provocar bacteriemia que induce fiebre alta. S. e. e infecta palomas y falcónidos.

ENTRADA POR FAGOCITOSIS INDUCIDA POR EL PATÓGENO Existen diferentes alternativas en cuanto la entrada a fagocitos: 

Fagocitos no profesionales tienen escasa actividad antibacteriana son el hábitat ideal para el microbio que usa receptores de superficie celular para invadir sus células huésped (epiteliales y endoteliales).

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

Granulocitos polimorfonucleares. Son células efectoras antibacterianas. Son muy destructivos para los microbios: tienen actividad antibacteriana constitutiva. Presentan una vida muy corta, por lo que no son una buena opción para la infección crónica. Deben ser continuamente reemplazados. Su falta (neutropenia) es un factor de susceptibilidad a estas infecciones.



Fagocitos mononucleares. Son a la vez hábitat de infección y célula efectora antibacteriana. Tienen actividad antibacteriana inducible, que depende de su estado de activación que es controlado por receptores PAMP y células T (IFNγ). La inducen células Th1 y Tc.

MECANISMOS DE INFECCIÓN MOLÉCULAS INDUCTAS DE LA ADHESIÓN E INVASIÓN Mecanismo Zipper. Señalización y endocitosis del receptor al que se han adherido específicamente. -

Yersinia (integrina) y Listeria (internalina-e-cadherina de la célula epitelial humana) no entra en murina por mutación en posición 16.

-

M. leprae se une a la laminina de los nervios periféricos y células de Schwan.

Mecanismo Trigger. Mecanismo no dirigidos a un receptor especifico. -

S. enterica y Shigella sp. inducen reorganización de la actina del citoesqueleto causa ruffling e incorporación indiscriminada de otras partículas (macropinocitosis).

RECEPTORES PARA EL RECONOCIMIENTO Los fagocitos profesionales expresan receptores para reconocer estructuras conservadas de patógenos que normalmente no están presentes en el huésped (= patrones moleculares asociados a patógenos; PAMP). Los receptores para reconocimiento de patrones (PRR). Los receptores PRR inducen fagocitosis y liberación de mediadores proinflamatorios. PAMP + daño+ reacción al daño = infección dañina Entre estos podemos distinguir: -

Familia del receptor toll. Diferencia distintas estructuras únicas de los microbios: glicolípidos, lipoproteínas, hsp, flagelina, RNA y oligonucleotidos raros que inducen señalización intracelular y activación celular.

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-

Glicoproteínas tipo lectina C con especificidad frente a azucares comúnmente expresados superficie bacteriana y que inducen fagocitosis.

-

Moléculas de superficie CD14 con especificidad por glicoplípidos como el LPS de gramy los lipoarabinomananos (LAM) de las mycobacterias.

Receptores PRR Se pueden distinguir dos tipos de receptores PRR: -

-

Que median la unión microbiana y su fagocitosis. Entre estos hablamos de: -

Receptores lectina tipo C

-

Tipo manosa. Reconoce N-acetilglicosamina, manosa (LAM con manosa terminal) glucosa y L-fucosa.

-

Tipo fucosa une L-fucosa.

-

CD14 reconoce Lipoarabinomananos terminados en arabinosa.

Que reconocen moléculas del huésped: -

Inmunoglobulinas

-

Complemento C3R reconoce varios ligandos C3d, secuencia RGD β-glucanos no estimula secrección de radicales oxidantes.

-

Fibronectina proteína de matriz celular que se une a integrinas celulares, tras el daño queda expuesta. FnR se une a secuencia RGD (Arg-Gly-Asp) secuencia que establece la adhesión.

La función de los receptores es la unión de componentes bacterianos y su endocitosis (receptores basureros, receptores de complemento, CD14 y receptores de manosa) y activar células TLR y FcR (fagocitos no profesionales como las células endoteliales y epiteliales intestinales que tienen TLR). Ligandos de los TLR: -

TLR1: Lipopéptidos.

-

TLR2: LAM y lipoproteínas de Mycobacterium.

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TLR3: RNA bicatenario.

-

TLR4: LPS de muchas bacterias gram- y hsp.

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-

TLR5: flagelina bacteriana de gram+ (Listeria) y gram- (Salmonella).

-

TLR6: peptidoglicano zymosan.

-

TLR7: ssRNA.

-

TLR8: ssRNA.

-

TLR9: oligonucleótidos con CPG dinucleotidos sin metilar característicos del DNA bacteriano.

*Los TLR generalmente interaccionan con sus ligandos en el fagosoma.

FAGOCITOSIS Y EVOLUCIÓN DEL FAGOSOMA 

Fagosoma temprano. Tiene pH neutro o ligeramente básico que permite la actividad de defensinas bactericidas para algunas cepas de Salmonella y Listeria) y proteínas básicas.



Fagosoma tardío. Adquiere un pH ácido débil por acción de la bomba de protones.



Fagolisosoma. pH ácido fuerte en él las enzimas lisosomales degradan bacterias previamente lisadas.

Patógenos como Mycobacterium, Legionella, Salmonella y Clamydia detienen la maduración del fagosoma y viven en fagosomas en un estadio intermedio entre 1 y 2. Sobreviven y evitan estimulación PAMP.

Supervivencia en el fagosoma 

Interferencia de la maduración del fagosoma. Los glicolipidos de mycobacterias impiden la fusión fagolisosomal aunque los anticuerpos anti-pared revierten esta capacidad. Detienen la maduración del fagosoma excluyendo la bomba de protones del fagosoma



Resistencia a enzimas. Su pared celular rica en lípidos les hace muy resistentes contra el ataque enzimático.



Resistencia a acidificación. Los m.o. secretan ureasa que produce NH4 que tampona el pH del fagosoma.

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Competición por el hierro entre la bacteria y el huésped El hierro extracelular está retenido en transferrina y lactoferrina. La transferrina es captada por el CD71 TFrR; el hierro se libera de la transferrina en las condiciones reductoras del fagosoma temprano y las bacterias lo captan. Las bacterias intracelulares tienen proteínas de unión a hierro: sideróforos, proteínas de unión a transferrina, proteínas similares al grupo hemo. *Experimento con expresión de CD71 en infección experimental por Legionella y Mycobacterium.

Se observa una reducción de la expresión de CD71 (TFRR) en macrófagos activados. Esta reducción de la expresión de CD71 basta para matar Legionella por deprivación de hierro. Sin embargo, no mata Mycobacterium que tiene exoquelinas y mycobactinas muy eficientes captando hierro.

Moléculas efectoras tóxicas Hablamos de radicales del oxígeno y del nitrógeno, moléculas tóxicas altamente reactivas destruyen las bacterias. -

Reactive oxigen intermediates (ROI) (superóxido, peróxido de hidrogeno) son muy activos contra bacterias extracelulares dañan DNA, proteínas y lípidos de membrana.

-

Contra intracelulares son más importantes los Reactive Nitrogen Intermediates (RNI) la iNOS inducida por IFNγ produce oxido nítrico NO· y peroxinitrito ONOO-

-

Granulocitos y monocitos pero no macrófagos tienen mieloperoxidasa que produce ácido hipocloroso.

*Ratones KO de iNOS son susceptibles a listeriosis y tuberculosis. Las bacterias intracelulares evitan la destrucción por estos radicales tóxicos mediante la entrada a través de unión a CR1/CR3, la cual no induce el estallido respiratorio. Ejemplos concretos pueden ser: -

Existencia de un glicolípido fenólico en Mycobacterium leprae, que consume radicales oxidantes.

-

S. entérica con SPI2 excluye NADPH oxidasa de la mb del fagosoma.

-

Algunas bacterias intracelulares producen superóxido dismutasa y catalasa, que detoxifican O2 y H2O2.

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OTRAS ADAPTACIONES Evasión desde el fagosoma al citoplasma. Listeria virulenta produce listeriolisina. La deleción del gen responsable la vuelve avirulenta. Es una estrategia muy exitosa pues para evitar daños colaterales la lisis bacteriana se limita al fagolisosoma. La evasión es reducida en macrófagos activados por el IFNγ. Invasión de células adyacentes sin exponerse a los anticuerpos y los fagocitos activados. Desde células de Kupffer a hepatocitos adyacentes inducen formación de seudópodos y fusión de membranas. Inducción de apoptosis de células diana tras su incorporación. Ej.: M. tuberculosis, S. enterica, L. monocytogenes.

RESPUESTA A BACTERIAS INTRACELULARES Inmunidad natural. Se produce la fagocitosis por neutrófilos y macrófagos. Algunas bacterias resisten degradación por macrófagos. Las células NK y Tγδ matan células infectadas con sus gránulos. Mycobacterium resiste. Inmunidad específica. Es principalmente celular: los linfocitos T CD4 producen IL-2, CD8 y DNγδ y IFNg que hiperactiva macrófagos que forman granulomas.

1. Estadio inicial (fagocitos activados). Se produce la atracción de fagocitos a lugares de replicación bacteriana por citocinas proinflamatorias y quimiocinas, fagocitosis y muerte intracelular. Los monocitos se diferencian en DC y producen IL-12. 2. Estadio intermedio (linfocitos T no convencionales y NK). Intervienen células NK, y linfocitos T no convencionales NKT y γδ que producen IFNγ 3. Estadio tardío (linfocitos T antígeno específicos CD4 y CD8). Las células T convencionales antígeno específicas expandidas estimulan formación de granulomas (fagocitos hiperactivados) que controlan la infección. Estos clones expandidos son responsables de la memoria inmune.

Papel de las citocinas Participan en los procesos de reclutamiento leucocitario, la (hiper)activación de macrófagos, la inducción de respuesta protectora de células T, la formación del granuloma y la regulación negativa de la respuesta.

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Los macrófagos y células dendríticas producen una serie de citocinas que actúan sobre CTL, y estos una serie de citocinas que afectan a MO y DC. Son fundamentales: IL12, IL18, TNFα e IFNϒ.  Fagocitos y células citotóxicas se estimulan mutuamente.

Cuando falla TNFα los granulomas no se forman bien.

Hay que responder a las bacterias produciendo granulomas, pero también hay que ser capaz de detener el proceso. Existe un equilibrio entre controlar la respuesta y no responder del modo adecuado. Esta regulación negativa es importante.

PAPEL DE LAS CITOCINAS Los macrófagos y células dendríticas producen una serie de citocinas que actúan sobre CTL, y estos una serie de citocinas que afectan a MO y DC. Son fundamentales: IL12, IL18, TNFα e IFNϒ.  Fagocitos y células citotóxicas se estimulan mutuamente.

Hay que responder a las bacterias produciendo granulomas, pero también hay que ser capaz de detener el proceso. Existe un equilibrio entre controlar la respuesta y no responder del modo adecuado. Esta regulación negativa es importante. 

Reclutamiento leucocitario.



(hiper)activación de macrófagos.



Inducción de respuesta protectora de células T.



Formación del granuloma.



Regulación negativa de la respuesta.

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1. Reclutamiento leucocitario Quimioquinas producidas por MP y células endoteliales y epiteliales. Cada quimioquina atrae a unos tipos celulares. Son receptores promiscuos: un receptor se puede unir a varias quimioquinas. -

CXC atraen MP (fagocitos mononucleares)

-

CC atraen PNG(granulocitos polimorfonucleares) y monocitos CCR2

-

CX3C atraen linfocitos y células NK

*La terapia debe actuar sobre los quimioreceptores. Citocinas inflamatorias (IL-1, IL-6, TNF). Producen una respuesta de fase aguda (IL-6), fiebre (IL-1) y caquexia (TNF).

2. Activación de macrófagos IFNγ activa macrófagos para que maten bacterias intracelulares como Listeria. Para matar Mycobactrerium es necesario también TNFα, vitamina D3 y el péptido antimicrobiano cathelicidina.

3. Inducción de respuesta protectora de células T (Th1) El tipo de respuesta se determina poco después de la entrada de la bacteria en el huésped. La IL-12 es el factor de polarización crucial producido por MP y DC que favorece en pri...