Bioanalytik - WS 2019 PDF

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WS 2019...

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Bioanalytik Zusammenfassung

WS 18/19

Inhaltsangabe

1

EinfÜhrung .................................................................................................. - 5 1.1

(Jablonski – Diagramm) .............................................................................. - 5 -

1.1.1

2

Optische Spektroskopie ......................................................................... - 6 2.1

(Absorption) ................................................................................................... - 6 -

2.1.1

3

Ubergangsdipolmoment: ......................................................................................... - 6 -

Proteinabsorption .......................................................................................................... - 8 -

2.2

(XAFS Spektroskopie) .................................................................................. - 9 -

2.3

(IR - Absorption) ....................................................................................... - 10 -

2.3.1

Messtechniken: .............................................................................................................. - 11 -

2.3.2

Fourier-Transformation IR-Spektroskopie:..................................................... - 12 -

Licht (IRRAS, ORD, CD)........................................................................... - 13 3.1.1

Elektromagnetische wellen ................................................................................. - 13 -

3.2

(Lineare Polarisation) ................................................................................. - 13 -

3.3

(Zirkulare Polarisation)............................................................................... - 14 -

3.3.1

Optical Rotatory Dispersion (ORD)................................................................... - 14 -

3.3.2

Circulardichroismus (CD-Spektroskopie) ......................................................- 15 -

3.4

(Lichtstreuung) ............................................................................................ - 17 -

3.4.1

Rayleigh-Streuung: .....................................................................................................- 17 -

3.4.2

Mie-Streuung: ................................................................................................................. - 18 -

3.5

(Dynamische Streuung) ............................................................................ - 19 -

3.6

(Inelastische Streuung) ............................................................................. - 21 -

3.7

(Fluoreszenz) ............................................................................................... - 22 -

Stokes-Shift: .......................................................................................................................................- 23 -

4

3.7.1

Fluoreszenzmessung ................................................................................................... - 24 -

3.7.2

Fluoreszenzpolarisation & -anisotropie ..........................................................- 26 -

3.7.3

Forster resonance energy transfer (FRET): ................................................... - 29 -

3.7.4

Fluoreszenzkinetik: ........................................................................................................- 30 -

NMR-Spektroskopie ............................................................................... - 31 -

-2-

WS 18/19

4.1

(Spin und Grundlagen) ............................................................................. - 31 -

4.1.1

Grundlagen ..................................................................................................................... - 31 -

4.1.2

Prazession .......................................................................................................................... - 33 -

4.1.3

Abschirmung .................................................................................................................. - 33 -

4.2

(Chemische Verschiebung).................................................................... - 34 -

4.3

[Kopplungen] ............................................................................................. - 35 -

4.3.1 4.4

[Eindimensionale Experimente] .............................................................. - 37 -

4.4.1 4.5

5

Kopplungskonstante .................................................................................................. - 36 -

Einfaches experiment mit Pulsverfahren......................................................- 37 -

[Zweidimensionale Experimente] ........................................................... - 39 -

4.5.1

Grundlagen .....................................................................................................................- 39 -

4.5.2

COSY-Spektrum ............................................................................................................ - 41 -

4.5.3

TOCSY-Spektrum .......................................................................................................... - 42 -

4.5.4

NOESY-Spektrum .......................................................................................................... - 43 -

4.5.5

HSQC-Spektrum............................................................................................................- 43 -

Chromatographien und Elektrophorese ............................................ - 44 5.1

(Chromatographie).................................................................................... - 44 -

5.1.1

Einleitung ........................................................................................................................... - 44 -

5.1.2

Ionenaustauschchromatographie ................................................................... - 48 -

5.1.3

Reversed Phase Chromatographie (HPLC)................................................ - 50 -

5.1.4

Hydrophobe Interaktionschromatographie ..............................................- 52 -

5.1.5

Affinitatschromatographie .................................................................................... - 53 -

5.1.6

Grossenausschlusschromatographie .............................................................. - 54 -

5.2

(Elektrophorese) ......................................................................................... - 55 -

5.2.1

Grundlagen .....................................................................................................................- 55 -

5.2.2

Elektrophorese Gele .................................................................................................. - 57 -

5.2.3

Isoelektrische Fokussierung .................................................................................... - 60 -

5.2.4

Zweidimensionale Gelelektrophorese ...........................................................- 62 -

5.2.5

Kapillarelektrophorese ............................................................................................. - 64 -

5.2.6

Ultrazentrifugation .......................................................................................................- 66 -

-3-

WS 18/19

6

7

Kalorimetrische Verfahren .................................................................... - 67 6.1

differential scanning calorimetry............................................................ - 67 -

6.2

isothermale Titrationskalorimetrie ........................................................... - 68 -

Fehlerbetrachtung ................................................................................. - 69 7.1

(Systematische Fehler) .............................................................................. - 69 -

7.2

(Statistische Fehler) .................................................................................... - 71 -

7.2.1

Grundgrossen ................................................................................................................. - 71 -

7.2.2

Konfidenzintervalle: ....................................................................................................- 72 -

7.2.3

t-Test .....................................................................................................................................- 72 -

7.2.4

Fehlerfotrpflanzung .................................................................................................... - 73 -

7.3

9

(Signal Rausch-Verhaltnis) ....................................................................... - 73 -

Massenspektrometrie ............................................................................ - 74 9.1

(Grundlagen) .............................................................................................. - 74 -

9.2

(MALDI -–TOF) ............................................................................................. - 75 -

9.2.1

Ionisierung (MALDI) ..................................................................................................... - 75 -

9.2.2

Massenanalysator (TOF) ..........................................................................................- 77 -

9.2.3

TOF-TOF .............................................................................................................................. - 78 -

9.2.4

Detektor (SEV) ................................................................................................................- 79 -

9.2.5

Ubersicht ............................................................................................................................ - 79 -

9.3

(ESI - MS) .................................................................................................... - 80 -

9.3.1

Quadrupol ........................................................................................................................- 81 -

9.3.2

Ionenfalle ..........................................................................................................................- 82 -

10 Rontgenstrukturanalyse ........................................................................ - 83 10.1

(Rontgenbeugungsprinzip) ................................................................... - 83 -

11 Elektronenmikroskopie ......................................................................... - 84 11.1

(Grundlagen) ........................................................................................... - 84 -

11.2

(TEM).......................................................................................................... - 84 -

12 Rasterkraftmikroskopie ......................................................................... - 85 -

-4-

WS 18/19

1 Einf Ü hrung Man unterscheidet die Spektralbereiche des elektromagnetischen Spektrums:

1.1 (Jablonski – Diagramm) o

Veranschaulicht die mögliche Übergänge der Valenzelektronen in die verschiedene Anregungszustände bei Einstrahlung von Licht und züruck.

-5-

WS 18/19

1 . 1 .1 Ubergangsdipolmoment:

2 Optische Spektroskopie

-

Fähigkeit, elektromagnetische Strahlung absorbieren zu können Direkt proportional zur Polarisierbarkeit

2.1 (Absorption) o

Wichtige Voraussetzung für die Absorption ist das Vorhandensein eines Übergangsdipolmoment. 𝜇"#$% = '( Ψ%∗ '(𝑟") ∗ Ψ#∗ '(𝑟") ∗ 𝑒 ∗ 𝑟" ∗ 𝑑𝑉

Es gibt zwei Möglichkeiten: Ψ(𝑥, 𝑦, 𝑧) = 'Ψ(−𝑥, −𝑦, −𝑧)−→ 𝑔𝑒𝑟𝑎𝑑𝑒'𝐹𝑢𝑛𝑘𝑡𝑖𝑜𝑛 Ψ(𝑥, 𝑦, 𝑧) = ' −Ψ(−𝑥, −𝑦, −𝑧 )−→ 𝑢𝑛𝑔𝑒𝑟𝑎𝑑𝑒'𝐹𝑢𝑛𝑘𝑡𝑖𝑜𝑛

o

-

Gerade à Gerade: Gesamtintegral = 0

-

Ungerade à Ungerade: µ = 0

-

Gerade à Ungerade: µ ¹ 0 ABSORPTION

Vorsicht: Gemessen wird die Extinktion (Absorption + andere Komponenten, wie die Streuung)

Die Absorption gibt Aussagen über eine mikroskopische Grösse, durch eine makroskopische photometrische Methode -

#

Lambert-Beersche Gesetz: 𝐴 = ' log D EF = '𝜀 ∗ 𝑐 ∗ 𝑑 #

o

Voraussetzungen: 1. Absorbierende Substanz muss homogen in Lösung verteilt sein 2. Keine Lichtstreuung 3. Keine Photoreaktion in der Lösung

-6-

WS 18/19

o

Häufige Fehler bei der Photometrie: • Fluoreszierende Probe: §

Folgen: Intensität am Detektor zu hoch à geringe Absorption

§ • Nicht

Abhilfe: Verdünnung ausreichend

gefülte

Küvette • Nicht exakt im Strahl justierte Mikroküvette: §

Abhilfe:

EInsetzen

einer Abdeckmaske • Streuende Probe: Intensität wird aus dem Strahl ,,herausgestreut” §

Intensität am Detektor zu niedrig,zu hohe Absorption

§

Abhilfe:

Detektor

grossflächigen

dicht Detektor

an

der

Probe

montieren,

verwenden,

spezielle

Probenkammer, Ulbrichtkugel, Erhöhen des Brechungsindex des Lösemittels.

-7-

WS 18/19

2 .1. 1 Proteinabsorption -

Dipolmoment

in

der

Peptidbindung

ermöglicht die Absorption bei 205 nm. -

Bei 280 nm absorbiert die aromatische Aminosäure Tryptophan

-

Sekundäre Strukturelemente besitzen eigene Absorptionsspektren

-

DNA-Basen können auch selbst absorbieren und verusachen normalerweise Verunreinigungen (etwa 260 nm)

-8-

WS 18/19

2.1.1.1 -

Anwendungsbeispiele:

Warburg-Christian: Konzentrationsbestimmung durch Messung der Absorption bei 280 nm und bei 260 nm (Subtraktion von A260 da diese die ,,Verunreinigung” der Nukleinsäuren beschreibt). CProtein = 1,55 * A280 – 0,76* A260

-

Goldfarb,

Saidel,

Mosovich:

Konzentrationsbestimmung

durch

Messung der Absorption bei 205 nm (Peptidbindung, man sollte die sekundäre Struktur wissen) o

Nachteil: Auch Absorptionsmazima von vielen Aminosäuren

cJKLMNOP = -

QR

STEU ∗V

,

wobei X= Schichtdicke der Quarzküvette

Bradford-Assay: Färbung durch Coomassie Brilliant Blue o

Wechselwirkungen mit Arginin stark, nicht so stark mit Lys, Hist, Trp, Tyr, Phe.

o

Absorption bei 595 nm

2.2 (XAFS Spektroskopie) -

Röntgenabsorptionsspektroskopie

-

Detektion von Metallzentren

-

Absorption ist proportional zur Anzahl der emittierte Photo-Elektronen

-

Man braucht ein durchstimmbares X-Ray: Synchrotron

-

Elektronen auf Kreisbahn über Magnetfeld à Brennstrahlung o

Je nachdem wie scharf die Kurve, desto stärkere Strahlung

o

Frequenz kann eingestellt werden, z.B Röntgenstrahlung

-9-

WS 18/19

2.3 (IR - Absorption) Benutzung der Wellenzahl statt Wellenlänge: 𝜈(𝑐𝑚$R ) = '

RYZ

[\]]\^]ä^`\'( ^a)

Im Vergleich:

o

UV/VIS beschreibt die Elektronenübergängeeines harmonisches Oszillator mit Dn ± 1 mit einer sehr hohen Absorption (teilweise MIR auch) o

Beschreibung durch zwei Massen, die unterschiedlich stark schwingen können (Kompression und Ausdehnung)

o

Die Massen werden durch reduzierte Masse beschrieben: 𝜇 =' R

f

𝑚R ∗ 𝑚b 𝑚R + 𝑚b

o

Die Frequenz: 𝜈 = '

o

Nur diskrete Energieniveaus sind erreichbar, beschrieben durch:

bd

∗' e

g

E(n)

= (v + 0,5 ) * n mit v = Schwingungsquantenzahl

o

Die IR-Schwingungsübergänge werden durch anharmonische Oszillatoren beschrieben (hohe Energieniveaus sind erlaubt) mit eine ca. 100-fache niedrigere Absorption o

Dieses Modell beschreibt die Realität der Molekülschwingungen §

Kleinen Abstand: positive Ladungen stossen sich gegenseitig ab, sodass die Potentialkurve steigt (bei kleinen r)

§

Grossen Abstand: Molekül dissoziiert. - 10 -

WS 18/19

o

o

Keine äquidistante Energieniveaus sondern Dn = ±1, ± 2, ± 3…. à Entstehung von Oberwellen, die die

F = 3 N = ftrans + frot + fvib

Absorption im NIR/VIS Bereich erklären

Fvib= 3N - ftrans - frot

Freiheitsgerade beschreiben die Anzahl der unabhängig

voneinander

Bewegungsmöglichkeiten

eines

Moleküls

(abhängig von N = Atomanzahl)

o

o

Linerare Moleküle: f = 3N – 5

o

Nichlineare Moleküle: f = 3N – 6

Wichtige

Voraussetzung

für

die

Linear

Nichtlinear

ftrans

3

3

frot

2

3

fvib

3n – 5

3n -6

f

3n

3n

IR-Spektroskopie

ist

das

Änderung

des

Vorhandensein eines DIpomoments. o

Rotation

entsteht

durch

periodische

Dipolmoments. o

Anwendung: Analyse der Glykokalyx der Bakterien

(Zuckernahängsel

an

der

Membran) sowie Peptide und Proteine

2 . 3 . 1 Messtechniken:

o

IR-Küvetten

besitzen

eine

sehr

geringe

Schichtdicke, wobei die optische Weglänge etwa 5-10 µm lang ist. o

Bei den Prinzip der abgeschwächten Totalreflexion wird der Lichtstrahl in einem hochbrechenden Material wie ein Lichtleiter geführt.

- 11 -

WS 18/19

2 . 3 . 2 Fourier-Transformation IR-Spektroskopie: Strahlungsquel...