Biochemische Analytik 01 PDF

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Sommersemester, Dr. Patrick Ziegelmüller...

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Proteinreinigung Proteine müssen normalerweise aus einer großen Menge Ausgangsmaterialien und einer Unmenge anderer Proteine gereinigt abgetrennt und isoliert werden. Dabei ist eine gute Ausbeute mit gleichzeitigem Erhalt der biologischen Aktivität von großer Bedeutung. Die Reinigung der Proteine ist oft mir viel Zeitaufwand verbunden und setzt voraus, dir Trennmethoden und Eigenschaften von Proteinen zu kennen.

Eigenschafen von Proteinen Proteine findet man in allen Zellen im Cytosol und in bestimmten Organellen. Hierbei unterscheidet man zwischen entfalteter Primärstruktur, welche aus bis zu 20 biogene Aminosäuren über Peptidbindungen verknüpft und gefalteter Sekundärstruktur, wobei es die α-Helix, βFaltblatt und β-Schleife gibt bei denen jeweils der Hydrophobe kern nach innen gerichtet ist und die polaren Reste nach außen zeigen. Die Trennung von Proteinen basiert auf ihrer Größe, Form, Ladung, Bindingungseigenschaften oder Hydrophobizität.

Chromatographie Die chromatographischen Techniken sind die für uns relevante Methoden um Proteine, die in Lösung sind zu trennen, da man mit verschiedener Techniken andere Substanzgruppen, andere Proteine und sogar ähnliche Proteine (Isoformen) abtrennen kann. Das Prinzip der Chromatographie funktioniert über die Reinigung des Proteingemisches durch eine Matrix. Die Matrix ist das Füllmaterial (stationäre Phase) wo das Laufmittel (mobile Phase) durchläuft. Führt man nach der Chromatographie ein Lösungsmittel ein um eines der Absorbierten Stoffe zu trennen, ist die dabei auslaufende Flüssigkeit das Eluat. Die Matrix geht bei der Chromatographie Wechselwirkungen mit den Proteinen ein, die jedoch keine Kovalenten Bindungen bilden. Die Art und Weise der Wechselwirkungen sind für verschiedene Techniken unterschiedlich. Der anschließende Schritt ist der Nachweis von Proteinen, die Protein-Detektion, erfolgt über die Photometrie, ein Messverfahren im Wellenlängenbereich von sichtbaren Licht. Hierbei wird über eine Strahlungsquelle Licht emittiert welches über eine Probe angeregt wird und von einem Detektor aufgefangen zu werden. Im groben unterscheidet man zwischen unspezifischer Detektion, wo alle Proteine nachgewiesen werden und der spezifischen Detektion, wo bestimmte Proteine nachgewiesen werden. Für die unspezifische Detektion sind die Wellenlänge λ = 280 nm für Detektion von aromatischen Aminosäuren wichtig und die Wellenlänge λ = 220 nm für die Detektion von Peptidbindungen wichtig. Bei der spezifischen Detektion wird auf besondere spektroskopische Eigenschaften, biologische Aktivität oder Enzymtest geachtet. Zudem kann man auch Immunologisch (keine Photometrie) mit Antikörpern nachweise erzielen.

Gelfiltration Das Prinzip der Ausschlusschromatographie trennt die Proteine nach Größe und Form. Hier liegt eine poröse Matrix vor, mit definierter Porengröße, sodass kleine Proteine in die Matrix eindringen und wandern langsamer, wohingegen die Größeren Proteine nicht in die Matrix eindringen können und weiterwandern. Hierfür ist die größeneinheit von Proteinen Dalton (Da) von bedeutung. Dies ist eine nicht SI-Konforme Masseneinheit wobei 1 Da [ u ] =

1 masse C12 12

ist. Dies ist etwa die Masse eines Wasserstoffatoms. Das herrauskommende Eluat kann nun detektiert werden und in einem Absorbtions/Zeit- oder Absorbtions/Volumen-Diagramm (Chromatogramm) dargestellt werden. Da größere Moleküle zuerst eluieren werden diese weiter links angezeit mit einer Absorbierung um etwa λ = 280 nm.

Diese Methode findet seine Anwendung in der Trennung von Salzen oder anderen niedermolekularen Soffen. Da das Elutionsvolumen anhängig von der Masse der Proteine ist hilft dies auch bei der Bestimmung der Molmasse. Darüber hinaus kann man mit dieser Methode Monomere von Multimeren trennen um hochmolekulare Proteinkomplexe zu analysieren.

Ionenaustauschchromatographie Die IEX trennt Proteine nach ihrer Ladung. Die Matrix trägt hierbei negative Ladungen (Kationenaustauscher) wobei positiv geladene Proteine sich über elektrostatische Wechselwirkungen mit der Matrix binden, die ungeladenen/negativ Geladenen fließen weiter. Die auftragung in einem Chromatogramm efolgt in zwei Schritten. Zuerst kommt der normaler ducrhlauf, wo die negativen und neutralen Proteine im Eluat sind. Naschließind wird schrittweise NaCl zugegeben um die an die Matrix gebundenen Proteine schrittweise zu Verdrängen und als Eluat zu detektieren. Die Absorbtion erfolgt wieder bei λ = 280 nm.

Zu beachten ist die Tatsache, dass die Ladung der Proteine abhängig vom pH-Wert ist, da sowohl Carbonylgruppen bei niedrigem pH-Wert als auch Aminogruppen bei hohem pHWert ein Proton abgeben. Die Gesamtladung des Proteins ist somit abhängig von dem pH-Wert der umgebenden Lösung (amphoteres Verhalten). Hierfür ist der isoelektrische Punkt (pl) von großer Bedeutung. Dieser charakterisiert den Neutralpunkt eines Proteins, wo sich positive und negative Ladung kompensieren. Überwiegen negativ geladenen Aminogruppen, ist der pl niedriger und man spricht von einem sauren Protein. Entsprechend bezeichnet man Proteine mit höherem pl als basisches Protein. Beispiel für die Ionenaustauschchromatographie eines Proteingemisches:

(oben: negative Matrix; unten: positive Matrix)

Affinitätschromatographie Die Affinitätschromatographie beruht auf spezifische und reversible Absorption eines Moleküls, an einen individuellen, matrixgebundenen Bindungspartner. Proteine binden sich Kovalent an die Matrix, wobei eine hohe Selektivität möglich ist, da nur Proteine mit Interaktion zur Matrix gebunden werden, während andere Proteine weiterlaufen. Fügt man anschließend die gebundene Stoffklasse hinzu (hier: G), wird das ursprüngliche Protein freigesetzt und kann als Eluat detektiert werden, wieder bei λ = 280 nm. Ein Chromatogramm sieht dann wie folgt aus:

Hydrophobizität Die hydrophobe Interaktionschromatographie (HIC) ist dadurch gekennzeichnet, dass die unpolare Oberflächenregion eines Proteins bei hohen Salzkonzentrationen an schwach hydrophobe Liganden einer stationären Phase absorbieren. Proteine bilden in wässriger Lösung jeweils einen Hydrophoben kern mit den hydrophilen Resten nach außen gerichtet, dies nennt man Hydratisierung. Dabei werden Wasserstoffbrückenbindungen gebildet, woraus eine Hydrathülle folgt. Gibt man nun Salz in die Lösung hinzu löst sich die Hydrathülle auf, und die Hydrophoben Proteinreste können mit der Matrix interagieren. Hierbei ist zu beachten, dass die Lösung mit einer passenden Menge Salz zugesetzt wird, sodass die Proteine aggregieren können. Die Lösung ist dann eine Suspension, welche als mobile Phase dient. Bei der HIC ist die Matrix eine Hydrophobe, weshalb es zu Interaktionen zwischen dieser und den Proteinen gibt, wobei sich die hydrophoben Oberflächen abhängig von der Ionenstärke binden. Hierbei gilt, je Hydrophober ein Protein ist, desto weniger Salz wird benötigt um dieses zu aggregieren. Deshalb wird hier anders als sonst die Trennung bei der Absorption erzielt, nicht bei der Desorption. In einem Chromatogramm kann das ganze ungefähr so aussehen (λ = 280 nm):

Eine andere Methode zur Trennung der Proteine nach ihrer Hydrophobizität ist die Reversed PhaseChromatographie (RPC). Hierbei ist ausschlaggebend, dass die Matrix eine höhere Hydrophobizität aufweist als bei der HIC, da diese längere C-Gerüste haben (C16 – C18). Durch diese wird wieder das Proteingemisch durchgeführt, jedoch erfolgt die Elution diesmal durch Zugabe organischer Lösungsmittel, welches mit dem Absorbierten Molekül um die Bindungsstelle konkurriert. Es ist möglich, dass für Proteine der Tertiärstruktur eine (irreversible) Denaturierung auftritt. Im Chromatogramm lässt sich hier erkennen, dass diese Methode die beste Auflösung hat und man somit über 100 Peptide voneinander trennen kann. RPC wird eingesetzt bei der Trennung von kleinen Peptiden und tryptisch verdauten Proteinen. Über 100 Peaks können mit einer HPLC-Anlage dabei voneinander getrennt werden.

Dialyse Häufiger kommt man zu Lösungen die zur weiteren Handhabung aufgrund ihrer Ionenstärke ungeeignet sind. Eine Methode der Entsalzung ist die Dialyse. Hierbei ist der wichtigste Bestandteil die Dialysemembran, dessen Poren kleinere Moleküle diffundieren lässt und größere Moleküle aufhält. Die Proteinlösung wird in einen Schlauch aus der Dialysemembran aufgefüllt, und in Wasser gegeben. Aufgrund der konzentrationsunterschiede zwischen Lösung und Wasser diffundieren Salze und beim Äquilibrium ist die Salzkonzentration in der Lösung drastisch gesunken. Wiederholen des Vorganges sorgt für eine fast salzfreie Lösung.

Aussalzen Beim Aussalzen werden die hydrophoben Eigenschaften von Proteinen ausgenutzt. Durch Zugabe von Salzen wird die Hydrathülle der Proteine entfernt und die hydrophoben Reste können miteinander interagieren. Dadurch fallen Proteine aus. Mithilfe der Protein-Fällung kann ein Proteingemisch einer groben Vorreinigung unterzogen werden. Nicht alle Salze sorgen für das Aussalzen von Proteinen. Man unterscheidet antichaotrope und chaotrope Salze. Antichaotrope Salze wie Ammoniumsulfat haben einen aussalzenden Effekt, durch Zugabe dieser Salze werden die Interaktionen der hydrophoben Proteinbereiche verbessert. Chaotrope Salze wie Harnstoff jedoch verringern hydrophobe Interaktionen und sorgen dafür, dass die Proteine in Lösung verbleiben.

Lottspeich, Friedrich (2006): Bioanalytik. 2.Auflage Seite: 13-16; 26-28; 215-233;...