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I LIVELLI DI ORGANIZZAZIONE STRUTTURALE DELLE PROTEINE (STRUTTURA SECONDARIA) Ricominciamo da dove ci eravamo interrotti la lezione precedente: avevamo parlato degli amminoacidi e delle proteine, e oggi parleremo dei livelli di organizzazione strutturale delle proteine che sono principalmente 4. Infatti abbiamo una struttura primaria, una secondaria, una terziaria e in alcuni casi, non sempre, anche una struttura quaternaria. L'organizzazione di questi diversi livelli di organizzazione strutturale può essere studiata con metodi diversi. Oggi vedremo principalmente ciò che concerne la struttura secondaria. Ritornando al legame peptidico, ribadiamo che questo è un ibrido di risonanza tra due forme, una forma prevede che il legame C-N sia un legame singolo, l'altra che sia un legame doppio, e quindi il legame peptidico ha caratteristiche intermedie tra questi due, e quindi contiene la caratteristica della coplanarietà tra tutti gli elementi e quindi questi devono necessariamente trovasi sullo stesso piano affinchè la risonanza possa esserci. Questo implica che se si prendono due amminoacidi successivi, si hanno anche due piani successivi in cui si posizionano gli atomi della catena principale. Abbiamo già detto che non è possibile la rotazione libera intorno al legame peptidico e quindi tra ciascun amminacido sono possibili soltanto due rotazioni : quella tra il C alfa e l'N ammidico, e a questo angolo rotazionale, diedrico, diamo il nome di φ (phi), e quella tra il C alfa e il C carbonilico, e a questo angolo diamo il nome di ψ (psi). Quindi non può ruotare il legame peptidico, m possono invece ruotare i due angoli i φ e ψ. Quindi se io prendo una catena peptidca più lunga, io ho una successione di piani che contengono tutti gli atomi della catena principale, e un piano può ruotare rispetto al successivo in funzione dei valori che andranno ad assumere gli angoli φ e φ e così via per tutti i piani. Quindi la catena della proteina non è necessariamente lineare, e dato che queste rotazioni sono permesse, la catena potrà assumere delle catene non lineari, ma tridimensionali nello spazio. Ora, si potrebbe pensare che gli angoli φ e ψ possano assumere qualunque valore, e in linea di principio

questo potrebbe essere vero se gli atomi delle proteine fossero veramente delle sfere, così come vengono rappresentati nei disegni. In realtà noi sappiamo che ogni atomo ha la sua dimensione e che le catene laterali, rappresentate sempre con delle sfere, possono essere molto grandi. Quindi nella realtà non è possibile assegnare a questi angoli qualunque valore, perchè solo determinate coppie di valori possono essere assegnati agli angoli di uno specifico amminoacido. Se un coppia di angoli diedri assumesse dei valoi non permessi, quello che succederebbe è che gli atomi dell'amminoacido successivo andrebbero a scontrarsi gli uni con gli altri, e questo ovviamente non è possibile. Allora questo argomento è stato studiato dal punto di vista teorico da un fisico indiano che si chiamava Ramachandran. Questo fisico si è andato a calcolare, senza spiegare come, i valori possibili degli angoli diedri φ e ψ all'interno di un segmento peptidico, e quello che ha tirato fuori è il cosiddetto grafico di Ramachandran.

In realtà in questo grafico sono rappresentate due categorie di dati, quelli teorici, calcolati da Ramachandran, e una serie di dati sperimentali. Innanzitutto nel grafico rappresentiamo l'angolo φ in funzione dell'angolo ψ. Quindi ciascun amminoaciso darà rappresentato all'interno del grafico con un puntino in funzione dei due angoli per qeull'aminoacido stesso. Se un ammioacido all'interno di una proteina ha una conformazione tale che il suo angolo φ è 0, e l'angolo ψ è 0 anch'esso, metterò un puntino nel punto del grafico corrispodente a rappresentare i due valori. Il risultato di Ramachandran è stato quello di elaborare teoriacmente i valori delle coppie di angoli diedri permessi per gli amminoacidi all'interno di una proteina, e questi valori, nel grafico, sono quelli compresi nelle linee tratteggiate. Quindi, se un amminoacido assume una coppia di angoli compresi nella linea, ciò è permesso, invece se i valori non sono compresi, ciò è teoricamente impossibile. Al giorno d'oggi è possibile vedere le proteine rappresentate nella loro struttura tridimensionale grazie a dei metodi per determinarli, e il metodo principe è la cristallografia a raggi X, ma ce ne sono anche altri. Tramite questi metodi conosciamo la struttura di più di 100000 proteine, e quindi conosciamo le coordinate atomiche di ciascun atomo di quella proteina, quindi a partire da un sistema di riferimento di assi cartesiani x, y e z, siamo in grado di assegnare una posizione a tutti gli atomi di quella proteina. Questo mi implica che io conosco per le proteine analizzate quali sono le coppie di angoli diedri assunte da ciascun atomo di quella proteina, e quindi i puntini neri all'interno del grafico sono punti sperimentali che derivano dall'analisi concreta di alcune proteine, e quello che si vede è che la stragrande maggioranza di questi puntini rientrano nell'ampiezza possibile calcolata solo teoricamente da Ramachandran, molto prima che fosse possibile studiare il fatto concretamente. Questo grafico vale per tutti gli amminoacidi tranne che per due: la prolina e la glicina. Perchè la glicina ha come catena laterale solo H, quindi il possibile minor ingombro sterico, e quindi il grafico di Ramachandran per la glicina è più ampio, cioè permette delle zone che non sono permesse per altri amminoacidi, quindi la glicina può assumere in altre parole coppie di angoli diedri che gli altri amminoacidi non possono assumere. Per la prolina è vero il contrario. Noi abbiamo visto che la prolina è un imminoacido piuttosto che un amminoacido, dato che la catena laterale della prolina è legata covalentemente all' N, e questo restringe il numero possibile dei valorri assumibili dalla coppia di angoli diedri, e infatti nel grafico ci sono molto meno zone permesse ed è più stretto. Quindi il legame della prolina conferisce rigidità a questo amminoacido, mentre la caratteristica della glicina le conferisce variabilità conformazionale. Questo grafico di Ramachandran individua quindi elementi di struttura secondaria. Parliamo quindi del primo livello di struttura proteica, che altro non è che una sequenza, una catena di

amminoacidi. La struttura secondaria invece è un po' piu complessa e ci sono due conformazioni principali, l'alfa elica destrorsa e il foglietto beta ripiegato. Nel grafico di Ramachandran ci sono diverse zone permesse, quelle più popolate sono per queste due conformazioni, ma ce n'è un' altra scarsamente popolata che vale per l'alfaelica sinistrorsa, ed è meno stabile di quella destrorsa. Che cosa indichiamo quindi con il termine di struttura secondaria, volendo dare una definizione precisa? La struttura secondaria è una struttura locale, quindi ha a che fare localmente all'interno di una struttura peptidica con ciò che succede a una serie di residui consecutivi fra di loro. Essa poi si riferisce alla sìdisposizione spaciale che questi segmenti peptidici hanno all'interno della sequenza. Per descrivere la struttura secondaria, bisogna prendere in cosiderazione solo gli atomi della catena principale, cioè quelli coplanari, senza tener conto della catena laterale. Quindi che cos'è un determinato elemento di struttura secondaria? E' una sequenza di amminoacidi all'interno di una sequenza più lunga, e tutti gli elementi di questo segmento di amminoacidi assume valori della coppia di angoli diedri simili fra loro. Perchè un alfaelica è detta così? Innanzitutto un'alfaelica è un alfaelica perchè se essa inizia per esempio al residuo 10, e finisce al residuo 25, tutti i residui dal 10 al 25 avranno coppie di angoli diedri simili fra loro e che cadono nello stesso intervallo sul grafico di Ramachandran. Dopodichè se il 26esimo residuo assume valori di angoli diedri diversi, lì finisce l'alfaelica e inizia qualcos'altro, che può essere un altro segmento di alfaelica, oppure un foglietto a ripiegamento casuale, così si dice, perchè nel ripiegamento casuale i residui consecutivi assumono valori di angoli diedri non simili fra loro, ma comunque permesse dal punto di vista energetico, e quindi in quel segmento non sarà possibile individuare nessuna struttura secondaria, visto che l'organizzazione, come dice il nome, è appunto casuale. Che cosa succede se un certo numero di residui consecutivi si trovano tutti ad assumere un certo valore di angoli diedri simli? Si forma un'alfaelica destrorsa. Che cos'è un alfaelica? E' possibile descriverla come una struttura formata da un asse immaginario intorno al quale si avvolge il polipeptide in maniera destrorsa, e come tutti gli elementi elicoidali, l'alfa elica è caratterizzata da una serie di elementi. Il più important e il passo. Il passo è la traslazione che c'è ad ogni giro dell'elica che nel caso dell'alfa elica, corrisponde a 5,4 A. (A= 10-10 metri). In chimica e biochimica utilizziamo l'Angstrom perchè è l'unità di misura che più si avvicina alla distanza di legame. Una distanza di legame C-H è infatti di circa 1 A, e questo ci permette in biochimica di parlare di distanze tra atomi con numeri semplici, senza ricorrere alle potenze negative del 10. Abbiamo detto che il passo dell'alfaelica è di 5,4 A, e questo passo in soldoni rappresenta la distanza che intercorre tra due elementi uguali tra un giro e il successivo. All'interno dell'alfaelica abbiamo un certo numero di residui per giro che sono 3,6, e questo ci permesse di definire un passo/residuo pari a 1,5 A, ma questo è un numero non troppo importante. Quindi, ricapitolando, le caratteristiche principali per l'alfaelica sono il passo e il numero di residui per giro. Perche l'alfaelica è così stabile, tant'è che nel grafico di Rmachandran la zona dell'alfaelica è la più popolata? Innanzitutto anche l'alfaelica fu ipotizzata teoricamente prima che fosse possibile studiarla sperimentalmente, e la prima ipotesi che fu fatta a riguardo fu che nella conformazione ad alfa elica si ha un alto gradi di stabilità dovuto a una grande presenza di legami idrogeno che si trova in condizione ideale, cioè che l'H donatore ammidico di un amminoacido, e l'O carbonilico accettore non dello stesso amminoacido, ma di quello di 4 posizioni successive, sono perfettamente allineati e si trovano a una distanza ideale di 2,7 A, ma ciò non toglie che ci possano essere legami idrogeno anche a 3A, ma questi saranno meno forti, e quindi dovrò spendere meno energia per romperli, rispetto a un legame idrogeno ideale. Allora vedete che lungo l'asse dell' elica formo tutta una serie di legami idrogeno, quindi ciascun gruppo carbonilico, ciascun ossigeno carbonilico di ciascun amminoacido che si trova in configurazione di alfaelica forma un legame idrogeno con ciascun azoto ammidico di un altro amminoacido che si trova all'interno della stessa alfaelica. Badate bene che non si stanno tirando in ballo, in nessun modo, le catene laterali, perchè non servono per spiegare l'alfaelica. Se io prendo 10 residui di alanina, questi avranno una certa tendenza (nel caso dell'alanina, piuttosto elevata) a formare un'alfaelica, ma i metili, che sono le catene laterali, non partecipano alla formazione di questi legami idrogeno di cui stiamo parlando, quindi non sono utilizzanti per l'alfaelica. Ciò però non è sempre vero. Nell'esempio appena fatto si, perchè per l'alanina la catena lateraleè un residuo piccolo e apolare, ma se le catene laterali sono ingombranti e polari, allora il discorso è diverso. Bisogna anche abituarsi a vedere come si rappresentano graficamente le proteine, come nelle rappresentazioni “ball and stick”, dove l'atomo è rappresentato come una palla, che in teoria è in scala, quindi tanto è più grande quanto è grande il raggio di Wan der vaals dell'atomo, e allora per l'atomo di

idrogeno la palla sarà piccola, per l'atomo di carbonio la palla sarà più grande. Per le catene laterali invece la forma è idealizzata. Da una visione dall'alto si può apprezzare la forma elicoidale dell'alfaelica e l'asse intorno al quale essa si attorciglia, e nella rappresentazione frontale, invece, si può apprezzare come le catene laterali si rivolgano tutte verso l'esterno dell'elica, e questo e ha una grande importanza per vari motivi. Come abbiamo detto prima, le eliche possono essere anche sinistrorse. In realtà le eliche sinistrorse sono meno stabili di quelle destrorse per una serie di motivi che hanno a che fare col fatto che gli amminoacidi sono della serie L. Quindi gli amminoacidi della serie L tendono a formare una struttura stabile con andatura destrorsa, mentre quando hanno andatura sinistrorsa sono meno stabili, anche se questa struttura è permessa secondo il grafico di Ramachandran. Quindi noi potremmo trovare una serie di resiui che hanno quei valori, ma non troveremo mai all'interno della struttura delle proteine un'elica che si sviluppa per più di un giro in modo sinistrorso. Per curiosità, alcuni scienziati hanno provato a sintetizzare chimicamente una struttura proteica, una proteina piccola, sostituendo tutti gli amminoacidi della serie L con gli stessi amminoacidi della serie D, e quello che succedeva era che gli amminoacidi della serie D tendono a fare esattamente il contrario di quelli della serie L, quindi invece di formare alfaeliche destrorse, formano alfaeliche sinistrorse, e quindi veniva fuori una struttura speculare a quella della proteina originale. Questo però è un esperimento di sintesi chimica, e non avviene in natura. Esistono però anche eliche diverse, come le eliche 3,6 su 13 (si chiamano di norma solo alfaeliche, ma per precisione si indica questa dicitura), dove 3,6 sono i numeri dei residui per giro e 13 sta ad indicare la distanza, in termini di numero di atomi, fra l'idrogeno donatore del legame idrogeno e l'ossigeno accettore. Quindi dando a questo idrogeno il numero 1, e numerando successivamente tutti gli atomi della catena pricipale, per trovare l'ossigeno accettore devo contare fino a 13. Esistono anche altre eliche, come l'elica 3-10, che ha un passo diverso, cioè contiene 3 residui per giro e la distanza, in termini di numero di atomi, che c'è tra l'ossigeno accettore e l'idrogeno donatore è di 10 atomi. Se si confrontano graficamente, si vede come l'alfa elica del 10 sia meno compatta dell'alfaelica standard. Succede spesso che le alfaeliche comincino come alfaeliche normali e finiscano, negli ultimi 2 o 3 giri, come alfaeliche 3-10, quindi all'inizio sono belle compatte e poi si allungano, fino ad assumere una conformazione random. Il legame peptidico è un legame polarizzato che presenta un momento di dipolo permanente tra l'azoto che ha una parziale carica positiva e con l'ossigeno carbonilico che invece ha una parziale carica negativa. Questo è vero per ciascun legame peptidico all'interno di una proteina, ma se noi andiamo a vedere che cosa succede all'interno dell'alfaelica, vediamo che, in virtù della conformazione dell'alfa elica, che è fatta per massimizzare i legami idrogeno che si formano proprio fra l'azoto ammidico e l'ossigeno carbonilico, tutti questi momenti di dipolo sono allineati e hanno tutti la stessa direzione, e quindi in qualche modo si sommano, e possiamo immaginare che l'alfaelica stessa abbia un suo momento di dipolo, con l'estremità N terminale carica positivamente e l'estremità C terminale carica negativamente, e questo ha una sua importanza, in tanti casi.

La mioglobina, per esempio, ha una struttura formata completamente da alfaeliche, e se proviamo a estrarne una, vediamo che i legami idrogeno di quell'alfaelica sono un po' storti, perchè la struttura di alfaelica descritta è una struttura ideale, mentre nella realtà dei fatti, la struttura viene declinata in tante maniere diverse, pur mantenendo la struttura. Infatti nel grafico di Ramachandran ci sono diversi valori di coppie di angoli diedri permessi per le alfaeliche, non è che ci sono solo due valori, e quindi c'è all'interno dell'alfa elica una certa variabilità. Cosa conferisce questa variabilità? La conferisce il fatto che se è vero che io posso descrivere un alfaelica solo in termini di interazioni fatte da atomi della catena principale, devo tener conto del fatto che ci sono anche le catene laterali, e le catene laterali possono essere più o meno stabilizzanti per un'alfaelica stessa, e quindi produrre delle distorsioni nello scheletro carbonioso che forma l'elica, e quindi anche delle variazioni nel comportamento ideale dei vari legami idrogeno, perchè le catene laterali tendono ad affacciarsi esternamente all'elica, quindi l'elica gira e io avrò una serie di catene laterali. A seconda di come sono queste catene laterali, e di come sono in relazione con le loro vicine, esse deformano l'elica, ad esempio, se io ho un residuo carico positivamente in una certa posizione ed un residuo carico negativamente nella posizione speculare nel giro successivo, allora questi due residui formeranno un ponte salino e questo è stabilizzante, mentre se questi residui sono tutti e due negativi questo è destabilizzante e quindi l'elica si andrà a distorcere un pochino. Abbiamo detto che l'alfaelica ha un momento di dipolo permanente, che è piccolo ma non trascurabile, con N terminale positiva e C terminale negativa, e allora una una catena laterale negativa vicina all'estremità N terminale sarà stabilizzante , mentre se vicina all'estremità C terminale sarà destabilizzante. Questo allora implica che io non posso dire che un dato amminoacido formerà sicuramente una struttra specifica alfa o beta..ci sono ovviamente delle tendenze, tipo alcuni amminoacidi tendono a organizzarsi in stutture alfa e altri in beta, ma in generale possiamo trovarli in entrambi i tipi di strutture, perchè la struttura non è influenzata solo dalla natura degli amminoacidi, ma anche e soprattutto dalla natura dei vicini. Altra caratteristica delle alfaeliche è che esse possono essere anfipatiche, cioè che tendono a chiudere il core idrofobico della proteina, come nella mioglobina, le cui alfaeliche anfipatiche sono quindi da un lato esposte al solvente, e dall'altro esposte a una zona idrofobico. Quindi queste alfaeliche devono avere due diverse proprietà, perchè deve essere solubile in un ambiente apolare da un lato, e deve essere invece solubile in un ambiente polare dall'altro, e ciò si ottiene tramite la successione degli amminoacidi che la compongono, quindi queste sono caratteristiche dovute alle catene laterali dell'alfaelica stessa. Infatti se estraiamo questa alfaelica dal suo contesto e andiamo a vedere strutturalmente com'è fatta, possiamo vedere che dal lato esposto al solvente ci sono residui carichi positivamente e negativamente, mentre dall'altro lato c'è una successione di residui apolari. Uesta cosa avviene anche nelle proteine di membrana, dove una parte dell'alfaelica sarà esposta alla parte apolare dei fosfolipidi che formano la membrana, mentre l'altra, per esempio nei canali di membrana, sarà esposto al solvente. Parliamo ora dei foglietti beta. Cominciamo col dire che la struttura secondaria in sé per sé è il filamento beta, cioè le coppie di angoli diedri descrivono, nel caso delle strutture o conformazioni beta, un peptide completamente allungato e

disteso, sempre permesso dai calcoli di Ramachandran. I foglietti beta si trovano normalmente in natura, e anch'essi sono stabilizzati da legami idrogeno. Al contrario dell'elica, la struttura del filamento beta è lineare, e poi i legami idrogeno sono fatti sempre tra l'ossigeno carbonilico di un amminoacido e l'idrogeno ammidico di un altro amminoacido, e di nuovo, come prima, non c'è bisogno di considerare le catene laterali per descrivere il foglietto beta, ma comunque ci sono legami idrogeno tra i residui che appartengono a foglietti diversi. Questo significa che io posso fare diversi filamenti che interagiscono tra di loro con legami idrogeno, e così si andrà a formare un foglietto. La caratteristica che differenzia i foglietti beta dalle alfaeliche è che le alfaeliche sono strutture estremamente locali, nel senso che i residui che la formano sono uno consecutivo all'altro, per quanto riguarda i foglietti beta, invece, io posso avere un filamento tra l'amminoacido 10 e quello 20 e un altro filamento fra l'amminoacido 100 e quello 110, e questi d...