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INTRODUCCIONCatálisis por Oxido-reducción. Cisteína↔cistina, grupos prostéticos y/o metales.Puede ser general o específica:En la catálisis ácido-base expecíica, los H+ o los OHpromueven la reacción, sólo depende del pH. En catálisis ácido-base general una especie protonada o desprotonada facilita la...

Description

Alumno. Kyrsten Joany Bobadilla Riveros

PRÁCTICA No11 REACCIONES ENZIMÁTICAS DE ÓXIDOREDUCCIÓN.

Grupo 2OV1

INTRODUCCION Catálisis por Oxido-reducción. Cisteína↔cistina, grupos prostéticos y/o metales. Puede ser general o específica: En la catálisis ácido-base expecífica, los H+ o los OHpromueven la reacción, sólo depende del pH. En catálisis ácido-base general una especie protonada o desprotonada facilita la reacción, depende del pH y de la concentración del amortiguador.

OBJETIVO Determinar la actividad de algunas enzimas que participan en reacciones de óxido-reducción y discutir la importancia de los cofactores y el efecto de algunos inhibidores.

DIAGRAMA DE FLUJO 1. OBTENCIÓN DEL SISTEMA DESHIDROGENASA LÁCTICA (LDH)-NAD+ A. Obtención de la coenzima NAD+ Sacrificar una rata con éter y obtener 6 g de músculo de las patas traseras. Se puede utilizar músculo previamente congelado.

Recuperar el sobrenadante y etiquetarlo como "Coenzima NAD+".

Centrifugar a 2 500 rpm durante 15 minutos.

Cortar el músculo en fragmentos pequeños.

Pasar la preparación a un mortero con aproximadamente 1 g de arena y triturar el músculo hasta homogeneizar.

Colocarlos en un matraz Erlenmeyer con 24 mL de agua.

Hervir durante 5 minutos y ajustar con agua destilada al volumen original.

Triturar el músculo en frío.

B. OBTENCIÓN DE LA DESHIDROGENASA LÁCTICA (LDH) Sacrificar una rata con éter y obtener 6 g de músculo de las patas traseras. Se puede utilizar músculo previamente l d

Cortar el músculo en fragmentos pequeños y colocarlos en un mortero previamente sumergido en hielo.

Adicionar 24 mL de NaCl 0.9 % y aproximadamente 1 g de arena

Centrifugar a 2 500 rpm durante 15 minutos y desechar el precipitado en una bolsa de plástico proporcionada por el profesor.

Recuperar el sobrenadante y etiquetarlo como "LDH".

2. OBTENCIÓN DE LA DESHIDROGENASA SUCCÍNICA "SDH" Y CITOCROMO OXIDASA. Sacrificar una rata con éter y obtener el corazón. Se pueden usar corazones previamente congelados

Partir el corazón a la mitad, lavarlo con agua fría hasta que quede libre de coágulos y después cortarlo en fragmentos pequeños

Colocar los fragmentos en un mortero previamente sumergido en hielo, y adicionar 25 mL de Na2HPO4 0.06 M pH 7.0, y aproximadamente 1 g de arena.

Triturar el corazón en frío.

Recuperar el sobrenadante, completar al volumen necesario con solución de fosfatos, y etiquetarlo como "SDH-Cit".

Centrifugar a 2 500 rpm durante 15 minutos.

2. DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA a) DESHIDROGENASA LÁCTICA Preparar una serie de 5 tubos según se indica en la tabla. Hacer observaciones a los tiempos indicados anotando en el cuadro el grado de decoloración con cruce.

b) DESHIDROGENASA SUCCÍNICA Preparar una serie de 7 tubos de acuerdo a lo indicado en la tabla siguiente. Hacer observaciones a los tiempos indicados anotando en el cuadro el grado de decoloración con cruces.

c) CITOCROMOS Y CITOCROMO OXIDASA. Preparar una serie de 8 tubos de acuerdo a la tabla siguiente. Hacer observaciones a los tiempos indicados anotando en el cuadro los cambios de color de las soluciones....