Bloque 2.- Transgénesis, clonación y reprogramación PDF

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Juanjo...

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BLOQUE 2 TRANSGÉNESIS, CLONACIÓN, REPROGRAMACIÓN ANIMALES TRANSGÉNICOS:

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INTRODUCCIÓN:

El objetivo que trata este bloque es generar animales transgénicos. La utilidad principal de estos animales transgénicos en la actualidad es la de usarlos como biofactorías, es decir, utilizar sistemas biológicos animales que sirvan como medio de producción de un producto biológico de alto valor añadido. Esto ya es una realidad, por ejemplo, ya hay en el mercado un fármaco (antitrombina) producido en la leche de vacas transgénicas o también ya se comercializa un anticuerpo monoclonal producido en la leche de conejas. Las perspectivas futuras de la transgénesis en animales ponen el foco en la generación de animales de ganado (producción de leche, carne, piel, etc.) que presenten resistencias a enfermedades o plagas.

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NOCIONES BÁSICAS DE TRANSCRIPCIÓN: Un promotor es un elemento de la transcripción que puede ser considerado de forma compleja y general, como un conjunto de elementos que permiten la transcripción. Sin embargo, nosotros lo consideraremos como la secuencia aguas arriba de la ORF de un gen (cis). Dentro de la secuencia del promotor, resaltamos el core promoter, que es la secuencia donde van a unirse los elementos que van a posibilitar la transcripción de la ORF. En el core promoter, encontramos la caja TATA, que es una secuencia a la que se le une la TATA binding protein (TBP). A esta TBP se le unen los factores de transcripción genéricos, comunes para muchos genes, a los que se les unen, a su vez, los coactivadores. A la estructura formada por la TBP, los factores de transcripción basales y los coactivadores, se le llama el complejo mediador. La ARNpol, la enzima que realiza la transcripción propiamente dicho, es capaz de reconocer el complejo mediador y le es termodinámicamente favorable unirse a él y a la doble cadena de ADN y abrir la misma para comenzar la transcripción. Después de la ronda de transcripción, la ARNpol puede volver a unirse al complejo mediador y realizar otra ronda de transcripción o bien dejar el sistema. La tasa de transcripción de un gen depende, precisamente, de la frecuencia de reiniciación de rondas de transcripción y esto, a su vez, depende de que haya un ambiente bioquímico favorable para dicha reiniciación, que es conseguido por la acción de otros factores de transcripción, ya específicos para cada gen. Además, existen secuencias que favorecen la transcripción, como los enhancers e, igualmente, también hay secuencias que entorpecen la transcripción, como los silencers.

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CASETES DE EXPRESIÓN: La forma de hacer expresar proteínas recombinantes (exógenas) en animales es vía casetes de expresión. En el caso de usar animales transgénicos como biofactorías, se suelen usar casetes de expresión con promotores tejido-específicos para concentrar la producción de la proteína recombinante en órganos o tejidos concretos (ej. glándulas mamarias). Por lo contrario, para generar animales transgénicos resistentes a enfermedades/estreses, se suelen usar promotores constitutivos que se expresan en todos los tejidos, para así asegurar la resistencia del organismo completo. Además del promotor, también es importante elegir un terminador adecuado, que no suele ser el endógeno del transgén, sino uno del animal hospedador. También pueden usarse terminadores de virus, que suelen ser igualmente efectivos y más económicos.

Estructura general de un casete de expresión:

P – ORF – T | Insulator | Gen resistencia

Acompañando al transgén, también se añade un gen marcador de resistencia, lo más normal a antibiótico, al cual también habrá que colocarle un promotor adecuado y que se sirve como herramienta de selección en cultivos de células animales hospedadoras. Se escoge un promotor que no se exprese en el tejido diana de producción de la proteína, aunque algunas veces puede que sí se exprese (leaky expression). Para solucionar esta expresión residual del gen de resistencia en el animal hospedador, se utilizan elementos génicos llamado insulators. Éstos son secuencias de ADN que aíslan una región del genoma, haciendo que los eventos que se dan en dicha zona no afecte a las zonas de cromatina adyacente, formando loops que ejercen un impedimento estérico sobre los elementos transcripcionales (complejo mediador, ARNpol…). De esta manera, los insulators suelen colocarse en medio del gen de resistencia y el transgén para que la actividad transcripcional del segundo no produzca leaky expression del primero. Hay que tener en cuenta que, mientras más grande es un constructo, más inestable es porque, por ejemplo, es más susceptible a recombinación y además los insulators introducen presión mecánica que puede dar lugar a DSBs. Por ello, en los casos en los que no importe que haya leaky expression pueden no ponerse.

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GENERACIÓN DE ANIMALES TRANSGÉNICOS (TRADICIONAL): La transgénesis comenzó haciéndose en ratones, porque son organismos modelos simples y los resultados que se obtienen con su estudio pueden extrapolarse a humanos. Se usaron 2 principales métodos experimentales para conseguir ratones transgénicos:  Método 2 (transformación de pronúcleos): Se inyectaba el vector de expresión con el transgén en uno de los dos pronúcleos (masculino y femenino) de un óvulo ya fertilizado, para que dicho pronúcleo lo integrara en su genoma. Después, se dejaba que el óvulo siguiese su ciclo natural, con la fusión de los pronúcleos y formación del cigoto. Este cigoto, que ya es heterocigótico para el transgén inyectado, se llevaba hasta blástula y se implantaba en el útero de una ratona que hacía de madre hospedadora, hospedando el embrión y dándolo a luz. La descendencia resultante, se cruza entre sí para obtener de nuevo descendencia, que ya es homocigótica para el transgén. La desventaja de este método es que la tasa de éxito, es decir, la frecuencia de obtención de un ratón heterocigótico era muy baja: 1/10000 y además no se tiene control sobre dónde y cuántas copias del constructo se integran y cómo afecta a la célula. Sin embargo, nos podemos asegurar de forma directa que el ratón transgénico es heterocigótico completo (ya que todas las células derivan del cigoto).  Método 1 (transformación de ESC): Se cultivaban células madres embrionarias (ESC) de ratón y se las transformaba con el constructo y después se seleccionaban (ej. gen de resistencia y antibiótico) las que lo habían integrado en su genoma. Luego, a las células seleccionadas se les hacen estudios para ver el nivel de expresión del constructo, cuántas copias se han integrado, dónde ha ocurrido la inserción, etc. Una vez seleccionadas las células que han integrado de forma estable el constructo y que lo expresan correctamente, éstas se podían implantar en una blástula de ratón (células silvestres) y ésta, a su vez, en una ratona que hacía de madre hospedadora, dejando acabar el desarrollo embrionario hasta el final. Los ratones que se obtenían eran organismos quimera, porque estaban formados por células transgénicas que contenían el constructo y por células silvestres. Entonces, para obtenerse un ratón transgénico al completo (en todas sus células) era necesario que las células transgénicas fueran destinadas a formar la línea germinal, haciendo así que la descendencia resultante de un cruce entre el

ratón quimera y uno silvestre ya sí sea heterocigótica completa. Finalmente, al igual que en el método 2, se cruzan ratones heterocigóticos entre sí para obtener ratones homocigóticos para el transgén. La ventaja de este método es que puedes obtener un ratón transgénico asegurándote ya que el constructo se ha integrado y se expresa de forma correcta y estable sin ningún efecto negativo para las células. Sin embargo, se tiene que confiar en el azar para que las células transgénicas formen parte de la línea germinal y, si se da el caso, se necesitan 2 generaciones para obtener un ratón transgénico heterocigótico, mientras que con el método 2 sólo se necesita 1. Además, el cultivo celular de ESC es muy difícil, ya que tienen una viabilidad reducida y tienden fácilmente a diferenciarse. Una variable a tomar en cuenta es el nivel de expresión del constructo, que si no es el suficiente puede que no se dé el fenotipo deseado. En el método 1, esta variable es salvaguardada por los estudios que se le hacen a las ESC. Por el contrario, con el método 2 se va más a ciegas con respecto a este aspecto. Cabe decir que, con ambos métodos, hasta que no se tiene la descendencia (F2), no se puedes estudiar el fenotipo mutante conferido por el transgén en homocigosis.

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CLONACIÓN: Se desarrollaron técnicas de clonación de animales basadas en transferencia de núcleos de células a óvulos:  Transferencia de núcleo de ESC: Consiste en extraer el núcleo de una célula de la blástula e inyectarlo en un óvulo al que le han eliminado el núcleo por irradiación y dejar que la célula resultante complete el desarrollo embrionario completo, dando lugar a un organismo. Este proceso se puede repetir varias veces, usando varias ESC y óvulos recipiente, obteniéndose así varios organismos a partir de la misma blástula. Los organismos que se obtienen no son iguales a los parentales, sino a la descendencia, ya que hemos cogido células del embrión, resultado de la reproducción sexual de los parentales. Por ello, no se sabes de antemano cómo son los organismos que se van a obtener, pero sí sabes que todos los que obtengas serán idénticos genéticamente entre sí, es decir, serán clones.

Esto resultó con varios tipos de organismos, pero no con animales más evolucionados que las ranas.  Transferencia de núcleo somático (SCNT): Más tarde, en los 50, se reprodujo exitosamente esta técnica con células somáticas totalmente diferenciadas, pero igualmente no con animales más evolucionados

que las ranas, hasta el año 95, en el que por primera vez se consiguió clonar un mamífero, en concreto una oveja, la oveja Dolly.

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LA REPROGRAMACIÓN DE LA CROMATINA: Los perfiles de expresión de los distintos genes que conforman un genoma son definidos por los distintos mecanismos de regulación de expresión génica, siendo uno de los principales los de tipo epigenético. Las modificaciones epigenéticas son las responsables de los perfiles temporales de silenciamiento y activación de distintos genes a lo largo del desarrollo embrionario de un individuo. Hay genes que sólo necesitan expresarse en una etapa concreta del desarrollo embrionario y nunca más en todo el ciclo de vida del individuo. Por ello, en una célula de la blástula, parte del desarrollo embrionario ya acometido y habrá genes que ya se han expresado y ahora se encuentran silenciados. Igualmente, hay genes en las células adultas somáticas ya diferenciadas que se encuentran ya silenciados, porque sólo se expresan en el desarrollo embrionario o porque no se expresan en el tipo celular concreto. Lo que ocurre cuando se inserta el núcleo de una célula embrionaria o somática en un óvulo enucleado es que hay ciertos factores en el citoplasma de óvulo que llevan a cabo un conjunto de cambios epigenéticos sobre la cromatina del núcleo inyectado que resultan en la modificación de las marcas epigenéticas ya existentes, haciendo que el programa de expresión de los distintos genes “vuelva a comenzar de cero”. A este proceso se le llama reprogramación de la cromatina y es el que posibilita que se pueda obtener un nuevo individuo completo, que es genéticamente idéntico (clon) al organismo cuyo núcleo se inyectó. Como hemos dicho, este proceso no ocurría de forma exitosa hasta que se consiguió en 1995 con ovejas. La razón por la cual con otros animales superiores antes no funcionó y en el caso de Dolly sí es la siguiente: Las células usadas para SCNT fueron células de la glándula mamaria (totalmente diferenciadas), pero con la peculiaridad de que las habían matado de hambre en su cultivo in vitro y por ello se encontraban en quiescencia (G0), lo cual fue una característica crucial para el éxito de la clonación. Cuando una célula de estas se fusionó con el óvulo sin núcleo ni cuerpo polar, se mezclaron en el citoplasma común “factores” procedentes de ambas células. Es el equilibrio competitivo entre estos factores lo que determina si se produce la reprogramación de la cromatina del núcleo o no, o en qué grado se produce. Entre estos factores, podemos destacar las histona acetilasas (HAT) y las histonas desacetilasas (HDAC), que mantienen una competición actuando antagónicamente realizando modificaciones sobre la cromatina. Las HATs se dedican a acetilar los residuos de Lys de las colas N-terminales de las histonas, lo cual resulta en una reducción de la afinidad del ADN por las histonas y un aumento del grado de laxitud de la cromatina. Esto hace que el ADN sea más accesible para factores transcripcionales, activando la expresión génica. Las HDAC, por lo contrario, se dedican a desacetilar las histonas, lo que resulta en un aumento de la afinidad del ADN por las histonas y un aumento de la rigidez y compactación de la cromatina, haciendo que el ADN sea menos accesible a factores transcripcionales, reprimiendo la expresión génica. En esencia, la reprogramación de la cromatina consiste en acetilar las histonas, de forma que los genes que ya se expresaron en su momento y ahora se encuentran reprimidos (ej. gen de desarrollo embrionario) vuelvan a expresarse y así comenzar de nuevo el programa de expresión génica (“reprogramar”). El grueso de las desacetilasas en la célula resultante es aportado por la célula donadora del núcleo, mientras que el grueso de las acetilasas es aportado por el citoplasma el óvulo. Entonces, en el caso de Dolly, lo que ocurrió fue que la proporción desacetilasas/acetilasas era más baja de lo normal debido al arresto en G0 de la célula de la glándula mamaria (síntesis de proteínas inhibida), lo que resultó en un

desplazamiento del equilibrio hacia la actividad acetilasa, activación de genes y la consecuente reprogramación de la cromatina. La técnica de SCNT tiene una tasa de éxito mayor (1/1000) que la inyección de pronúcleos, aunque padece un cuello de botella, que es que la reprogramación de la cromatina no es completa, es decir, hay fragmentos de la cromatina que no se reprograman correctamente. Un ejemplo son los genes relacionados con respuesta inmune, que parecen mostrar reticencia al proceso de reprogramación, presentando un trastorno en su regulación génica en organismos clónicos, como con Dolly, que sufría inmunosupresión y autoinmunidad.

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PREOCUPACIONES DE LA TRANSGÉNESIS Y CLONACIÓN: Se han observado una serie de características en los distintos animales transgénicos clonados, aunque sólo de algunas de ellas se sabe que tienen una relación directa con la transgénesis o clonación. Entre estas características, se pueden destacar: agresividad, problemas motores, expresión residual (que puede acabar matando al animal en el desarrollo embrionario o en algún momento de su vida) y un tamaño mayor que el normal (pudiendo llegar a matar a su madre durante el desarrollo embrionario). De esta última anomalía, el exceso de tamaño, se sabe bastante sobre el fundamento que hay detrás: resulta que hay dos genes, IGF2 (insulin-like growth factor 2) y su receptor, IGF2R que están involucrados en el proceso de crecimiento y que están afectados por impronta genética (regulación epigenética). Precisamente, por estar afectados por impronta genética, la mala reprogramación de la cromatina provoca un trastorno en los mecanismos epigenéticos de regulación de su expresión, que se ve sobreactivada. Es esta sobreexpresión es la que provoca un aumento del crecimiento y la adquisición de un tamaño exageradamente mayor.  Cuando ocurre reprogramación -Después de la fertilizaci´n -En la formación de las células gaméticas (spermatogenesis y oogenesis) -Cáncer: En los tumroes hay muchos genes -Células que sufren transdiferenciación -Tras técnicas de somatic cell nuclear transfer.  Ciclo de reprogramación epigenética Cuando se fusionan célula femenina y masculina se borran las modificaciones epigenéticas de ambas y se vuelven a establecer de novo

En el pronúcleo materno las histonas ya van modificadas pero en el paterno no porque el espermatozoide no tiene histonas. Cuando se fusionan los gametos se dan muchas modificaciones del genoma. Esto no ocurre cuando el organismo proviene de clonación

REGULACIÓN EPIGENÉTICA DE LA EXPRESIÓN GÉNICA:

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Un fenotipo no es sólo resultado del genotipo de un organismo, sino que también depende del epigenoma, es decir, el conjunto de marcas epigenéticas resultado de la actividad de mecanismos epigenéticos de regulación de expresión génica (developmental history) y de la influencia del medio ambiente (que influye en epigenoma). Existen 3 tipos de marcas epigenéticas (en células somáticas adultas): 

Metilación del ADN: Consiste en la metilación (adición de grupos metilo −CH 3 ) directamente sobre la molécula de ADN. Se ha observado que esta metilación ocurre con preferencia en zonas del ADN ricas en nucleótidos de citosina (C) que están seguidos por uno de guanina (G) en la misma hebra de ADN, llamadas islas CpG. La metilación es una marca epigenética que se correlaciona con represión de la expresión génica, provocando que el ADN muestre una conformación más compacta y cerrada, siendo menos accesible a elementos reguladores (activadores/represores). Por lo contrario, una secuencia de ADN libre de metilación muestra una estructura más laxa y abierta, siendo más accesible a estos reguladores; bien es verdad que está abierto tanto a represores como a activadores, por lo que en un principio se podría favorecer tanto la represión como la activación de la expresión génica, pero parece que la influencia de los activadores supera a la de los represores, teniendo el resultado neto de un aumento de la expresión génica.

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Modificación post-traduccional de proteínas histonas: Las histonas son proteínas que se unen a la molécula de ADN y se enrollan a su alrededor formando estructuras llamadas nucleosomas, formados por 4 tipos de histonas diferentes: H2A, H2B, H3 y H4. Estos 4 tipos de histonas presentan colas N-terminales con una estructura no definida, pero sólo la H3 y la H4 presentan colas con aminoácidos susceptibles de sufrir modificaciones post-traduccionales, siendo las más importantes: fosforilación (Ser), metilación (Lys, mono/di/tri) y acetilación (Lys). La diversidad de modos de metilación (mono/di/tri) se usa para formar distintos patrones de metilación a lo largo del ADN de un gen, los cuales son usados por la ARNpol para “distinguir” durante el proceso de transcripción el inicio, el medio y el final del gen que está transcribiendo (5’ tri → di → mono 3’). Hay que entender que el ADN y las histonas no están en un estado estacionario de inmovilidad física, sino que están constantemente en un equilibrio dinámico de asociación/desasociación. El factor que determina la laxitud y grado de accesibilidad al ADN es la constante de reasociación del ADN con las histonas. De entre estos tipos de modificaciones, hay algunas relacionadas con el aumento de la expresión génica (ej. acetilación y desmetilación de

Lys) cuyo efecto consiste en la reducción de la afinidad del ADN por las histonas y, por tanto en la reducción de la constante de reasocación (enlentece la reasociación). Esto hace que el ADN esté más tiempo desasociado y, por lo tanto, aumentando la posibilidad de acceso y estabilidad termodinámica de interacción de éste con reguladores de la expresión génica (mayormente, activadores). Por lo contrario, también existen modificaciones correlacionadas con la represión de la expresión génica (ej. desacetilación y metilación) cuyo efecto consiste en aumentar la afinidad del ADN por las histonas, aumentando la constante de reasociación (acelerando la reasociación), provocando el efecto contrario. 

Proteínas no-histonas: Existen proteínas que no son histonas y que pueden ser permanente o temporalmente reclutadas al ADN, donde desempeñan funciones muy diversas: complejos remodeladores de la cromatina (CRCs) in/dependientes de ATP (ATPI/DCRCs)...