Capitulo 13- Ontogenia Y DiferenciaciÓn DE CÉlulas B Y T PDF

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CAPITULO 13-ONTOGENIA Y DIFERENCIACIÓN DE CÉLULAS B Y T La producción de células B o T maduras y funcionales involucra la conversión de una célula troncal pluripotente, cuyo fenotipo está fundamentalmente definido por la expresión de la molécula CD34. Los precursores linfoides más inmaduros no están plenamente identificados, aunque existe una serie de marcadores que han permitido adjudicar un cierto fenotipo a este precursor. La evidencia experimental indica que existiría una célula progenitora linfoide común para linfocitos B y T. Las señales de proliferación y diferenciación para cada tipo celular estarían dadas por el microambiente particular - interacciones celulares y los factores solubles- en el cual madura cada uno de estos tipos celulares (el timo para las células T, y la médula ósea y los órganos linfoides secundarios (OLS) para las células B) Como ya lo sabemos EN LA DIFERENCIACIÓN DE LOS LINFOCITOS B encontramos una etapa antígenoindependiente que ocurre en la médula ósea y una etapa antígeno-dependiente que ocurre en los OLS. LOS LINFOCITOS B VÍRGENES que emigran de la médula ósea expresan un receptor para antígeno tipo IgM e IgD. Luego de su encuentro y selección por el antígeno en los OLS, LOS LINFOCITOS B sufren un cambio de clase de inmunoglobulinas y, a través de un proceso de mutaciones, un aumento en su afinidad por el antígeno (y por lo tanto obtienen mayor especificidad.) LA PRODUCCIÓN DE LINFOCITOS T MADUROS ocurre en el timo. Los progenitores hematopoyéticos generados en la médula ósea migran al timo donde pasan por un activo proceso de diferenciación y proliferación. Los precursores T que llegan al timo no muestran ninguno de los marcadores típicos de los linfocitos T maduros, son CD4-CD8- (dobles negativos) y TCR-. Luego a partir de estas células se producen timocitos dobles positivos (CD4+CD8+) que expresan a su vez el TCR maduro. Finalmente estas células dobles positivas terminan generando la población madura de linfocitos circulantes T "helper" (LTh) CD4+ y linfocitos T citotóxicos (TLc) CD8+. Estos timocitos dobles positivos pasan por una doble selección antes de transformarse en simples positivos y salir a la circulación: una selección positiva que permite generar linfocitos T maduros que reconocen antígeno en función de su propio MHC (eliminándose los linfocitos T que no reconocen a su propio MHC) y una selección negativa que elimina los linfocitos T autorreactivos (que reconocen antígenos propios). REGULACIÓN GÉNICA DE LA DIFERENCIACIÓN LINFOCITARIA La maduración de linfocitos implica la progresión secuencial de una célula troncal pluripotente a través de estados intermedios de diferenciación para llegar finalmente a una célula absolutamente funcional. FACTORES DE TRANSCRIPCIÓN IMPLICADOS EN LA DIFERENCIACIÓN DE LOS ESTADOS MÁS TEMPRANOS DE LAS CÉLULAS LINFOIDES (Esto más que todo es experimental en ratones) Los factores de transcripción PU.1 e Ikaros participan en la diferenciación de la célula troncal hematopoyética al estado de célula progenitora linfoide. PU.1: participa en la regulación de la expresión del receptor de IL-7, requerido en la etapa de proliferación de la célula progenitora linfoide. Ikaros: es capaz de interactuar con los factores de transcripción Aiolos y Helios y participa en la especificación, diferenciación y homeostasis linfocitaria. Un defecto en la expresión de Ikaros impide el desarrollo de células precursoras tempranas.

La activación del programa de expresión génica específica de las células B en el siguiente estado de diferenciación (pre-pro-B) está controlada por la acción coordinada y cooperativa de los factores de transcripción codificados por el gen E2A (E12 y E47) y por el factor de células B temprano EBF. Estos factores regulan la expresión y el rearreglo de los genes de IgH e Igk y son requeridos para la adecuada expresión de los genes activadores de las enzimas de recombinación ( Rags). Dentro de los genes regulados por E2A y EBF se encuentra el gen que codifica para el factor transcripcional Pax-5 el cual actúa en el siguiente estado de diferenciación conocido como pro-B. Pax-5: puede actuar como un activador transcripcional cuando es expresado en bajas concentraciones y como un represor a altas concentraciones. En el caso de la maduración de los linfocitos T, se debe tener en cuenta: En primer lugar la célula progenitora linfoide puede seguir por la vía de maduración que conduce hacia el linaje de las células B o T. En segundo lugar, EL LINFOCITO T puede diferenciarse en células que expresan un TCRαβ o un TCRγδ y después, en el caso de los linfocitos TCRαβ, la elección debe ser tomada entre seguir hacia el linaje CD4+ o CD8+. ¿Cuáles son los determinantes en el destino final de los linfocitos T en la diferenciación? R/: Señales proporcionadas a través del pre-TCR, el TCR, factores solubles e interacciones celulares En el programa de diferenciación de las células T está sometido a un estricto control transcripcional: Entre los factores de transcripción que participan en estos procesos, las proteínas Notch cumplen un destacado papel de regulación. Estas pertenecen a una familia de receptores de transmembrana que regulan procesos de diferenciación neuronal y epidermal.

La inactivación inducible del gen Notch-1 en ratones recién nacidos o en células troncales de médula ósea conducen a un bloqueo temprano del proceso de diferenciación de las células T sin afectar el desarrollo de los linfocitos B o de algún otro linaje hematopoyético. A nivel molecular, se ha mostrado que la vía de transducción de señales de Notch es capaz de interferir con la actividad de la proteína E47 codificada por el gen E2A lo que explicaría la represión del programa de diferenciación de las células B. Hay evidencias que muestran que NOTCH-1 participaría en la determinación del linaje de linfocitos T que expresan un TCRαβ o un TCRγδ, así como también en la diferenciación hacia CD4+ versus CD8+. Conclusión: La Proteína Notch es muy esencial en la determinación del destino de las células T. El Modelo de diferenciación de células linfoides basado en la actividad diferencial de diversos factores transcripcionales ( que está en la figura 13-1) Nos explica que: En la médula ósea las células progenitoras linfoides serían refractarias a la estimulación del ligando de Notch-l debido a la ausencia de un estímulo adicional apropiado, lo que las conduciría a través de la diferenciación de células B. En estados tempranos de esta maduración la acción coordinada de los factores E2A y EBF activaría la expresión del programa de diferenciación génica de las células B entre los cuales se encuentra Pax-5. A su vez, la sobreexpresión de Pax-5 reprimiría la expresión de los genes específicos de los otros linajes celulares. -Por su parte, la célula progenitora linfoide que migra desde la médula ósea hacia el timo, encontraría en este microambiente las señales necesarias para activar la vía de transducción de señales de Notch. A su vez, Notch inhibiría la función del factor de transcripción codificado por el gen E2A bloqueando así el programa de diferenciación de células B en el timo. DIFERENCIACIÓN Y MADURACIÓN DE LINFOCITOS B Tiene 2 etapas: -ETAPA ANTÍGENO-INDEPENDIENTE (ocurre en la médula ósea) Las células troncales hematopoyéticas pluripotentes provenientes del hígado fetal colonizan la médula ósea reclutadas por la acción de la quimioquina CXCL12 secretada por las células del estroma medular. Estas células troncales tienen la capacidad de renovarse permanentemente y de dar origen a la totalidad de las células sanguíneas maduras (linfoides y mieloides). Recientemente, se ha identificado una célula progenitora que se caracteriza por una alta actividad mitótica (linfoide) es capaz de diferenciarse específicamente hacia el linaje de las células linfoides (células B, T y NK). Estudios científicos han evidenciado el requerimiento de IL-7 en la etapa de alta proliferación. LAS CÉLULAS PROGENITORAS LINFOIDES son conducidas hacia la diferenciación del linaje B debido a la activación de un programa genético específico La clasificación de los siguientes estados de diferenciación de las células B está definida, principalmente, por el rearreglo de los genes de cadena liviana y pesada de las inmunoglobulinas y por la ausencia o presencia de marcadores de superficie celular. Las células en el estado pro-B no producen inmunoglobulinas y se distinguen por la expresión de los marcadores CD19, CD43 y B220. En el siguiente estado de diferenciación, denominado pre-B, ocurre la recombinación de los genes V-D-J de las cadenas pesadas de las inmunoglobulinas y la síntesis y expresión citoplasmática de la cadena pesada (H) μ. PERO ESTAS CELULAS NO EXPRESAN INMUNOGLOBULINAS EN SU MEMBRANA ya que aún no sintetizan la cadena liviana (L), y por lo tanto son incapaces de reconocer o responder a antígeno.

Luego algunas de las cadenas H se asocian a una " cadena L de reemplazo" ( molécula estructuralmente similar a la cadena L normal) pero que no posee la región variable de ésta. Esta combinación constituye el receptor de células pre-B (pre-BCR), el que regularía la síntesis de las cadenas L y la consiguiente maduración de los linfocitos B. En la etapa siguiente de maduración (linfocitos B inmaduros): ocurre la recombinación de los genes VJ de las cadenas livianas y por tanto la síntesis de las cadenas livianas (κ o λ) las cuales se asocian con la cadena pesada +μ+ para generar una molécula de IgM en el citoplasma. Estos linfocitos B no pueden generar nuevas regiones variables (de cadenas L o H) en la médula ósea y se les considera funcionalmente inmaduros. De hecho, su encuentro con antígenos propios puede llevarlos a un estado anérgico (inactivación funcional) o de muerte celular más que a una activación. (Sin embargo, esta es una importante etapa de selección negativa de linfocitos B autorreactivos que podrían ocasionar enfermedades autoinmunes) Posteriormente, los linfocitos B son capaces de coexpresar moléculas de IgM y de IgD en la membrana celular. En esta etapa los linfocitos adquieren competencia funcional y son denominados células B maduras (figura 13-2).

LA REGULACIÓN GÉNICA mediada por diversos factores de transcripción y de IL-7, se conoce que proteínas tirosina quinasa de la familia Src y ciertos procesos adhesivos entre los linfocitos B en desarrollo y los elementos del estroma de la médula ósea actúan como factores inductores de la diferenciación de células B. Los linfocitos B virgen que expresan en su membrana receptores específicos para un determinado antígeno, salen de la médula ósea y entran en la circulación periférica. En la periferia, los linfocitos B vírgenes migran a los OLS donde completarán su proceso de diferenciación. Estas células B virgen expresan, simultáneamente, IgM e IgD de la misma especificidad en su membrana y de no encontrar antígeno mueren en unos pocos días o semanas. En los OLS , es donde se produce el cambio de clase de inmunoglobulinas y la maduración de la afinidad. Estos cambios se producen con una fiel mantención de la especificidad por antígeno. -Hay dos características importantes del proceso de diferenciación de los linfocitos B que aseguran la mantención de la especificidad antigénica: (a)"EXCLUSIÓN ALÉLICA" fenómeno que permite que aunque cada individuo heterocigoto recibe dos alelos de los genes para inmunoglobulina (uno de cada padre) sólo uno logra expresarse en cada linfocito y (b) "EXCLUSIÓN DEL ISOTIPO DE CADENA LIVIANA" que regula la expresión de las cadenas L de manera que cada linfocito B produce ya sea cadenas k o λ pero nunca las dos.

-ETAPA ANTÍGENO-DEPENDIENTE (que ocurre, en los OLS, lugar en el cual los linfocitos B específicos para un determinado antígeno, toman contacto con éste) En esta Etapa participan como elementos centrales el antígeno y los linfocitos T de ayuda (Th). Pero ciertos antígenos no proteicos tales como los polisacáridos y lípidos, no requieren de la ayuda de los LTR. Estos antígenos, son llamados Timo-independientes. Por otro lado, los linfocitos B que reconocen antígenos Timo-dependientes sí requieren de la colaboración de los LTh (encontrados por los linfocitos en los diferentes OLS: en el bazo para los antígenos introducidos por la vía sanguínea, en los ganglios para los antígenos colectados por la linfa, en las Placas de Peyer y tejido mucoso para antígenos ingeridos o inhalados y en la piel) Los linfocitos B migran a los folículos donde entran en contacto con elementos celulares del estroma llegando a formar los Centros Germinales (CG) ( zona de alta proliferación celular). Allí presentan una muy baja expresión de la proteína anti-apoptótica Bcl- 2, de manera que aquellos linfocitos B que no son rescatados por las Células Foliculares Dendríticas (CFD) a través de antígeno y de otras interacciones adhesivas mueren (son destruidas por macrófagos). MECANISMOS QUE LLEVAN A LA DIFERENCIACIÓN FINAL Y A LA PROLIFERACIÓN DE LOS LINFOCITOS B MADUROS EN UN GANGLIO LINFÁTICO (figura 13-3).

LOS LINFOCITOS B (al igual que los linfocitos T) entran al ganglio donde entran en contacto breve con los LTh, migrando a los folículos linfoides para formar allí, luego de un proceso de diferenciación y de una activa proliferación, los CG. En el folículo, LOS LINFOCITOS B entran en contacto con las CFD que se especializan en retener y presentar al linfocito B, antígeno sin procesar y en forma nativa (formando un icosoma que es un complejo con el anticuerpo) Esta interacción involucra, además del antígeno y el respectivo receptor (IgM/IgD) por parte del linfocito B, una serie de moléculas de adhesión y sus respectivos ligandos. Estas interacciones tienen como resultado la producción de citoquinas que inducen en el linfocito B nuevos procesos de diferenciación con cambios en la clase de inmunoglobulina y activa proliferación. Como resultado de estos cambios se generan los CG, los cuales poseen una estructura fina que contiene una zona oscura de centroblastos en activa proliferación y una zona clara (tiene la más alta densidad de CFD) que contiene los llamados centrocitos, células no proliferantes. Es en estos CG donde se generan los linfocitos B de memoria y donde ocurren las hipermutaciones de las regiones V de las inmunoglobulinas.

La IL-2 como IL- 10 han sido involucradas en la ayuda proporcionada por los linfocitos T y en la "decisión" final de los linfocitos B de tomar el camino de un linfocito B de memoria o de una célula plasmática productora de anticuerpos. DIFERENCIACIÓN Y MADURACIÓN DE LINFOCITOS T **IMPORTANTE** Los linfocitos T se originan en la médula ósea a partir de un precursor capaz de migrar al timo. Este proceso de maduración de los linfocitos T en el timo (denominados timocitos en oposición a los linfocitos T maduros que se encuentran en circulación), y la generación del repertorio de receptores de LT puede dividirse en tres etapas íntimamente relacionadas: (a) la migración de los progenitores de la médula ósea al timo, (b) la diferenciación de estas células progenitoras y (c) un proceso de selección. -Estos procesos deben generar un repertorio de linfocitos T maduros que cumpla dos requisitos fundamentales: primero que reconozca antígeno en función del propio MHC (restricción MHC) y segundo que estos linfocitos T no reconozcan antígenos propios (tolerancia). MIGRACIÓN DE LOS PRECURSORES DE LINFOCITOS T En humanos, una célula precursora de la línea T ha sido identificada en base a la expresión de la molécula de superficie CD34. Esta molécula se expresa en las células troncales pluripotentes de la médula ósea que dan origen no sólo a los linfocitos T sino que también a los linfocitos B, a las células dendríticas y a células endoteliales de la vasculatura. Estas células CD34+ de la médula ósea se transforman, al ser colocadas en un microambiente tímico en cultivo, en linfocitos T. Estos precursores expresarían en su superficie receptores de adhesión que se ligarían selectivamente al endotelio tímico permitiendo su entrada al interior del órgano. Uno de estos receptores podría ser la misma molécula CD34 ya que esta interactúa con la L-Selectina, una molécula de adhesión presente en los linfocitos. Una vez en el timo los precursores de los linfocitos T mantienen una alta capacidad proliferativa. DIFERENCIACIÓN Los estudios de la ontogenia y diferenciación de los linfocitos T se han realizado fundamentalmente usando como modelo el ratón. En este animal, los primeros precursores T se detectan en el timo en el día 11 de gestación ubicándose en la zona cortical de éste. A medida que los timocitos migran hacia zonas más internas de la corteza éstos van avanzando en su proceso de diferenciación. En estados finales de maduración los linfocitos T pasan desde la corteza hacia la médula y finalmente salen del timo a la periferia a través de las vías linfáticas o venas. Entre las diferentes citoquinas que las células estromales tímicas secretan, se ha identificado a IL-7 como un modulador directo de la sobrevida, diferenciación, transcripción y rearreglo génico del TCR. Además, la diferenciación de linfocitos T está sometida a un estricto control de expresión génica mediada por factores transcripcionales tales como GATA-3, E12, E47, HEB, NF-kB, Ikaros y Notch. Dos marcadores de superficie presentes en las células T han sido de gran utilidad en proporcionar información sobre los procesos de diferenciación de los linfocitos T, éstos son las moléculas CD4 y CD8. En base a la expresión de estos dos marcadores, la población de linfocitos T en un individuo adulto puede ser dividida en cuatro grupos: los linfocitos T dobles negativos (CD4- CD8-), los dobles positivos (CD4+ CD8+) que representan poblaciones más o menos inmaduras de linfocitos T y los simples positivos (CD4+ CD8- y CD4- CD8+) que corresponden a las poblaciones más maduras de linfocitos T. LAS PRIMERAS CÉLULAS DEL LINAJE T que aparecen en el timo se detectan en la corteza tímica externa y no expresan los marcadores CD4, CD8, TCR ni CD3, un marcador común de células T. Este estado de maduración es conocido como pro- T y los timocitos son denominados dobles negativos. Estas células, que representan aproximadamente el 5% de los timocitos expresan CD44 (una glicoproteína adhesiva de membrana), Thy-1 (en el ratón) y HSA (antígeno estable al calor). -En el siguiente estado de maduración conocido como pre-T, se inicia la recombinación y expresión de los genes de la cadena β del TCR la cual se asocia con una proteína invariante llamada pTα y con las proteínas del complejo CD3 (γ,+δ,+ε+ψ,+ζ) para dar origen al receptor de células pre-T o pre-TCR. Este complejo

proteico es capaz de transducir señales a través de la vía de proteínas tirosina quinasa Src y su actividad es esencial para la continuación hacia los posteriores estados de maduración. Aproximadamente, el 80% de estas células dobles negativas pasan por una etapa en la cual expresan la molécula CD8 (y el HSA) para dar origen, a un precursor CD4+ CD8+ doble positivo (ver en la figura 13-3). Estas células dobles positivas se encuentran en una etapa activa de rearreglo de los genes que codifican para la cadena α del receptor de las células T. El 20% restante de las células dobles negativas probablemente nunca expresan CD4 o CD8 pero sí expresan un TCR con las cadenas γδ. Estas células son los primeros linfocitos T que maduran en el timo y representan células que se diferenciarían por una vía independiente de los linfocitos T αβ. Posteriormente, los timocitos migran hacia la región tímica medular donde se diferenciarán en dos poblaciones distintas de células simples positivas; los LTh con fenotipo CD4+ CD8- (restringidos por MHC clase II) y los LTc con un fenotipo CD4- CD8+ (restringidos por MHC clase I). Estos dos tipos celulares expresan en su membrana altos niveles de TCRαβ y son células totalmente competentes capaces de migrar fuera del timo. SELECCIÓN TÍMICA En el timo ocurren dos importantes eventos de selección que son centrales en la generación del repertorio de linfocitos T maduros circulantes. Uno de estos procesos permite la generación de autotolerancia eliminando o silenciando aquellos linfocitos T que poseen una alta afinidad por antígenos propios (Selección Negativa). El otro proceso de selección deriva en la generación de linfocitos T maduros con un TCR capaz de reconocer el MHC (Complejo Principal de ...