Caryotype normal et pathologique PDF

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Dr Chantal Missirian ...

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Bases de la génétique médicale et moléculaire MISSIRIAN Chantal

Cours 5 Caryotype normal - Caryotype pathologique Trois grandes étapes évolution techniques de cytogénétiques : - Mise en place de marqueurs chromosomiques : bandes sur chromosomes qui permet de les identifier  Caryotype - 10 ans après : techniques de cytogénétique moléculaire : hybridation in situ en fluorescence : toujours utilisées lors d’exploration de patients avec déficience intellectuelle : permet de comprendre mécanisme chromosomique à l’origine du déséquilibre génomique observé. Permet de donner au famille le risque de récurrence pour une nouvelle grossesse pour savoir si impact sur apparenté du patient (sœur ou frère …) ? - Technique de puce à ADN Caryotype important pour patients avec la malformations isolées ou associées ou ayant déficient intellect : - Incidence de la déficience intellectuelle en population générale : 1-3% - Dans 80 % des cas on ne trouve pas l’étiologie de cette déficience Caryotype et puce à ADN : seul examens permettant d’avoir étude globale du génome. Permet de visualiser l’ensemble du génome. Différence entre les 2 : pourcentage des anomalies identifiés, 10% pour le caryotype à 20% sur une puce a ADN  puce à ADN a meilleur résolution. Caryotype : permet d’identifier anomalies du nombre et structure des chromosomes

Technique de cytogénétiques IEn 2 catégories : - Cytogénétique conventionnelle : pour caryotype standard ou de haute résolution  visualisation de chromosome - Moléculaire : hybridation in situ en fluorescence + techniques de puce à ADN Attestation de consultation à signer par le prescripteur : informations (limites de la techniques, qu’est qu’il va rechercher, et qu’est qu’on ne peut pas voir sur ce qu’il va prescrire) relatives à l’examen sont apportés aux patients par le prescripteur. Et en retour le patient signe consentement comme quoi il a compris, et à accepter Matériel sur lequel est réalisé le caryotype : - Le plus souvent : prélèvement sanguin : caryotype à partir de globules blancs (lymphocytes T). On travaille direct sur sang total : pas de séparation des différent cellules - Prélèvement cutané : caryotype sur les fibroblastes. Mosaïque cellulaire possible donc prélèvement de plusieurs tissus nécessaires. Orienté par examen cliniques ou par type d’anomalies recherchés. Patient a pu être greffée (moelle osseuse) donc cellules du sang = caryotype du donneur et non du patient  intérêt donc de l’interrogatoire et de la consultation en Amon - Fœtus : soit par ponction liquide amniotique (caryotype des Amniocytes) ou sur placenta (cellules trophoblastiques) Sur prélèvements :

Bases de la génétique médicale et moléculaire MISSIRIAN Chantal Culture cellulaire : caryotype ou hybridation fluorescence  anomalies de nombre (polyploïdie, aneuploïdie) ou structure (équilibrées et déséquilibrées) - Extraction d’ADN direct : réalisation du caryotype moléculaire ou ACPA (analyse chromosomique sur puce à ADN). Anomalies qu’on va pouvoir identifier sur ACPA, on appelle cela les CNV les variations du nombre de copies. Obligation de les valider par les hybridation en fluorescence pour d’abord éliminer les polyploïdie mais également comprendre les mécanismes du déséquilibre génomique de prévisualiser sur la puce à ADN. Intérêt de ces 2 techniques : - La résolution sur caryotype (taille des anomalies à identifier) : 5 megabase - Puce à ADN: 50 kilobase (meilleure résolution) -

1- Caryotype Obtention du caryotype : ADN lorsqu’il va être compacté au sein du noyau par différents mécanismes, enroulement de cette double hélice et puis la compaction de cette double hélice avec tout un réseau protéique. Chromosome et ADN : même entité histologique mais niveau de compaction différent. Pour visualiser chromosome il faut cellules en division : en mitose car ici compaction de l’ADN est maximale = stade METAPHASIQUE. On bloque ces cellules au stade métaphase avec injection de poison (colchicine : bloque le fuseau de division) dans milieu de culture qui contient cellule en suspension. Durer de culture variable en fonction du tissu à analyser : - Sang : 72 à 96h afin d’obtenir nombre suffisant de cellules : prolifération des lymphocytes durant ce temps - Cutané : 15 à 21 jours - Amiotique : 10 jours - Placenta : premier résultat 24h après prélèvement car cellules à haut index mitotique. Au terme de la division cellulaire : - Colchicine : arrêt du cycle cellulaire au stade métaphasique - Choc hypotonique : gonfler ces cellules pour faire éclater les membranes cytoplasmiques et permettent la dispersion de ces chromosomes - Fixation successives pour protéger la culture - Recueil ou étalement des chromosomes sur lame de verre - Coloration Giemsa des chromosomes et marquage chromosomique (qui fait apparaitre des bandes sur les chromosomes) : dénaturation - Analyse au microscope à contraste de phase En moyenne on capture 15 métaphase par patient et on va caryotype pour les 3 meilleurs. Des fois on peut demander un minimum 50 à 100 métaphase analysées au microscope.  Relativement manuel et chronophage. Technique de marquage : traiter ses chromosomes pour leur faire apparaitre de façon longitudinale sur le chromosome une alternance de bande claire et de bande sombre. Alternance de bande claire et sombre est spécifique à chacune des paires chromosomiques : permet de classer chromosomes. En fonction du degré de déspiralisassions, plus ou moins élevé de bandes. Résolution est fonction du nombre de bandes. Caryotype de bonne qualité : de 400 à 500 bandes par lots haploïdes de chromosomes. Deux techniques utilisées simultanément ou l’une ou l’autre : - Bande GTC - Bande RHG

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Bande CTG : cible certaines régions du chromosome

En métaphase le chromosome est constitué de deux bras, les chromatides qui sont reliées par le centromère (constriction primaire) : fixation ici des micros tubules qui permettront ensuite de séparer chromatides a moment de la division mitotique. Centromère délimite deux parties : bras court et long. A partir de la place du centromère  permet de faire différentes catégories de chromosomes. Coloration GIEMSA : Toutes les cellules ne sont pas en métaphase à l’observation, donc en interphase. Un nombre suffisant de cellules au stade métaphasique est nécessaire. Le marquage est relativement uniforme le long du chromosome. On voit les deux bras et le centromère.  Permet de compter chromosome : nombre de chromosome correct ou pas ? (46 ou non) Puis classification des chromosomes en fonction de la place du centromère et de la taille : permet identification de gros remaniement de la structure du chromosome - Classement du plus grand ou plus petit - Fonction aussi de la taille et de la position du centromère. Médian avec bras court et long identique = groupe de chromosome métacentrique Centromère position plus télomérique avec bras court plus petit par rapport à long = chromosome submétacentrique Chromosome acrocentrique : centromère pré télomérique : bras court +++ petits et constitués d’hétérochromatine : 5 paires chez l’Homme : 13, 14, 15, 21 et 22. Hétérochromatine : avec régions d’ADN hautement condensé, de l’ADN ribosomal (impliqué dans division mitotique). Cette structure particulière des bras courts est retrouvée uniquement sur ces paires de chromosomes. Si perte de ces bras courts sur ces paires de chromosome : aucune incidence phénotypique.  Bandes GTG Déterminer remaniement de la structure des chromosome Alternance de bandes claires, sombres et grise : spécifique à chacune des paires. Obtenu par traitement enzymatique suivie de GIEMSA. Les régions foncées = régions de réplication tardive au cours du cycle cellulaire et riche en bandes AT Permet de classer les chromosomes. Comparaison bande à bande entre chromosomes homologue et cela pour chaque paire chromosomique : permet de déterminer remaniement de la structure. Plus facile que R pour identifier un remaniement. Résolution quand perte d’une bande come sur le chromosome 1 : 5 Mb  Bande RHG Traitement par la chaleur, dénaturation thermique de l’ADN, marquage avec région télomérique plus marquées qu’en bandes G. Régions foncées (colorées par GIEMSA) = régions qui vont être de réplication précoce et régions riches en bandes GC. R pour « rivers » l’inverse de G. Les deux techniques se complètent. Certaines anomalies = plus visibles en bandes R et inversement.  Bandes CTG Régions centromériques seulement sont colorées mais également des constrictions secondaires. Régions d’hétérochromatine constitués d’ADN répété, non codant, localisée au niveau de certaines paire chromosomiques : 1, 9 et 16. Effectué lorsque l’on doute. Bras courts des chromosomes acrocentriques également bien marqués.

Bases de la génétique médicale et moléculaire MISSIRIAN Chantal Polymorphisme n’ayant aucun impact phénotypique : Par exemple un chromosome homologue peut être plus grand que son homologue mais pas forcément anomalie : centromère plus long par exemple. Cas du chromosome 1  Sans incidence pathologique  Différence de taille pas forcément pathologique. Chromosome 14 : bras court + long que son homologue. Chromosome surnuméraire qu’on n’arrive pas à classer : bande C permet de savoir de quoi il est constitué : si non marqué en bande C  composé de chromatine  impact possible au niveau du phénotype.  Caryotype normal Classement en fonction de la taille, des bandes R ou G, et préciser le nombre de chromosome (46 ou différent) et préciser le sexe (46, XX pour fille, et 46, XY pour garçon) Si aberration utilisation d’une nomenclature internationale variant avec le temps : aujourd’hui on utilise celle de 2016. Bandes permettent de délimiter des régions bandes - sous bandes désignées à partir d’une nomenclature bien précise : numérotation des bandes et sb du centromère jusqu’au télomère, que ça soit sur le bras court ou le bras long. Numéro 1 = régions proches du centromère. Pour exemple la région 3 de la région 1 du chromosome 7 : sous bandes chromosomiques. Séparées de la bande par un point  7 q 31.2 7 chromosome, q bras, 3 région, 1 bande et 2 la sous bande. La déspiralisassions des chromosomes augmente le nombre de bandes observées donc augmente la résolution. Caryotype standard : - 300-500 bandes/lot haploïde de chromosomes - 1 bande chromosomique : 1-2.107 pb - Identification de remaniement de 10 Mb Caryotype haute résolution : - 550-1000 bandes/lot haploïde de chromosomes - 1 sous-bande chromosomique : 1-5.106 pb - Identification de microremaniement de 4-5 Mb

2- Cytogénétique moléculaire Hybridation in situ en fluorescence (FISH) ou puce à ADN. Objectif : on applique principes de biologie moléculaire à du matériel histologique (chromosomes ou noyaux).

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Hybridation in situ en fluorescence

FISH : on utilise la propriété de l’ADN qui est que dans certaines conditions de température, de pH, teneur en sel, de se dénaturer : cad casser les liaison Hydrogène qui permettent de maintenir les deux brins. Obtenue en chauffant les chromosomes. Plus 2 e propriété de ADN : ADN monobrin peut rapparier en double brin si les deux brins monobrins sont complémentaires. Si pas complémentarité l’hybridation n’aura pas lieu. Donc en jouant sur T puis PH on pourra séparer puis recoller ses deux brins d’ADN. On utilise : - Sondes : séquences nucléotidiques Marquées par un voir plusieurs fluorochromes. Peuvent être commercialisées par différents laboratoires ou fabrication au sein même du labo. Reconnaissent certains régions spécifiques du chromosomes. Certains marques régions

Bases de la génétique médicale et moléculaire MISSIRIAN Chantal centromériques, télomériques et bras courts des chromosomiques acrocentriques si sont constituées de séquences d’ADN répété. - Sondes avec séquence unique : spécifique d’une région chromosomique donnée  sonde locus spécifique et également sonde peinture chromosomique : reconnaisse chromosome dans sa totalité Sont appliquées sur cible : - Chromosome sur lame de verre post culture cellulaire (FISH métaphasique) - Ou sur noyaux (FISH interphasique) - Aussi fibres d’ADN étirées (peignage moléculaire) : à partir d’extraction d’ADN on a pelote d’ADN  étire sur lame de verre  peignage moléculaire Principe Cible + sonde. 1 : on rend cible et sonde monobrin : chauffage pour rendre monobrin = dénaturation 2 : application de la sonde monobrin sur la cible = hybridation Si sonde reconnait sa séquence complémentaire sur chromosome : appariement 3 : lavage 4 : analyse au microscope à fluorescent : visualisation ou non du signal fluorescent La visualisation d’une anomalie chromosomique n’est pas toujours évidente : différence de taille peut être minime donc bonne résolution nécessaire ! On utilise un mélange de sondes : 1- Sondes qui reconnaissent en vert la région du centromère 2- En rouge, sonde locus spécifique dans région 15.q11.2 3- Sonde contrôle : plus distale en rouge Alternance vert rouge rouge Permet de voir que l’homologue n’a pas la région rouge centromérique : région absente donc non reconnu par la sonde.  Plus facile de visualiser perte de partie chromosomique en FISH que sur marquage en bande R. Autre exemple : matériel supplémentaire chromosome 3, 13 manque un morceau, 14 un chromosome plus long que chromosome homologue. Sondes locus spécifiques marquent le chromosome sur toute sa longueur. Chromosome 13 en vert ; or vert sur chromosome 3 marqué en rouge : translocation. Je veux m’assurer que c’est de l’ADN répété : chromosome 14 il y a polymorphisme de taille. Quand on l’utilise ?  Analyse ciblée, car lorsque on hybride choix d’une sonde, il y aura donc une orientation (vs globale pour le caryotype). Orientation clinique : - Sur le phénotype du patient par exemple ciblé un syndrome microdélétionnel par exemple le syndrome de ???  Anomalies sur le chromosome 15 - Suspections d’une trisomie 21 sur le fœtus cf échographie : fœtus atteint ? Utilisation sonde spécifique du chr 21 appliqué sur les noyaux, sur les Amniocytes et compter le nombre de signaux que l’on va observer Orientation cytogénétique (échange de chromosomes) - Caractérisation d’une anomalie chromosomique - Identification d’un chr surnuméraire : utiliser les centromères de chaque des paires chromosomiques jusqu’à voir quel centromère s’hybride sur ce chr surnuméraire - Evaluation d’une mosaïque cellulaire : compter des noyaux avec des sondes spécifiques du chr que l’on suspecte être en mosaïque - Contrôle des données issues de l’ACPA : mécanique chromosomique à l’origine du CNV observé

Bases de la génétique médicale et moléculaire MISSIRIAN Chantal Vu que c’est un analyse ciblée il faut : - Une bonne expertise clinique  orientation bonne sonde  on évite de passer à côté du diagnostic. - Connaissance des régions minimales critique des syndromes suspectés  études des régions subtélomériques : interprétation délicate, coûteuses => technique abandonnée au profit de l’ACPA - Microduplication : identification délicat Important de préciser à l’examen FISH sur quel chr car c’est une analyse CIBLEE : on doit savoir ce que l’on recherche pour la prescrire. (Multi FISH : non fait)  Caryotype standard Apporte infos sur nb et structure des chr. Relativement chronophage sur plan technique et sur plan d’interprétation. N’est pas automatisé. Expertise technique + dans l’interprétation donc temps d’apprentissage nécessaire pour biologiste pour apprendre à interpréter.  Pour l’hybridation in situ : Analyse ciblée, donc il faut orientation clinique mais aussi orientation cytogénétique  Donc nécessité de développer d’autres techniques d’identification chromosomiques de petite taille

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d’anomalies

Analyse chromosomique sur Puce à ADN (ACPA)

On travaille sur de l’ADN donc plus facile que sur culture cellulaire (pour hybridation in situ ou caryotype) : infection, mauvaise qualité = cellules mortes = nécessité de reprélever or si nn = gênant par exemple/ ADN : si ratage manipulation on a ADN dans tube donc manip peut être refait. On utilise support de lame de verre sur laquelle sont déposées toutes les séquences des fragments du génome humain normal. ADN du patient marqué avec fluorochrome rouge. C’est une technique comparative, on va donc comparer notre ADN vs ADN « normal », de référence. Lui est marqué différemment, ici en vert. Ensuite on va les mélanger de façon équimolaire (même quantité) : 1ug d’adn témoin – 1ug ADN patient. Une fois mélangé on dépose sur lame  même principe que l’hybridation IN SITU. Si complémentarité alors hybridation, et si pas complémentarité pas d’hybridation. Il y aura compétition pour hybridation quand les deux ADN sont en quantité égale. Pour une région génomique donnée si pas de déséquilibre entre deux ADN : autant ADN patient qui va venir s’hybrider que adn témoin vient se déposer  donc émission de fluorescence = JAUNE (mélange de rouge et de vert) : quantifier par logiciel. Donc : - Si pas de différence entre ces deux ADN en termes de QUANTITE  hybridation en même quantité. Donc quand mesure quantité de fluorescence émise par patient et témoin pour cette région : calcul ration  fluorescence émise patient/ fluorescente émise par le témoin. Dans ce cas le rapport doit être = à 1. Car 2 ADN patients (mère/père) / 2 patients. - Si excès fluorescence patient (rouge) : signifie que pour cette région génomique donnée le patient a plus d’ADN, est en excès par rapport au témoin : c’est un gain : 3 voire 4 voir plus de copies d’ADN patient / 2 ADN pour témoin. On parle de gain pour le patient. - Si excès fluo émise par le témoin pour région génomique donnée : perte pour le patient.  Calculer ce ratio de fluorescence permet de savoir pour chacune des régions génomiques que j’ai déposé sur la lame, de savoir si je suis en quantité équivalente, perte ou gain pour chaque

Bases de la génétique médicale et moléculaire MISSIRIAN Chantal région génomique donnée. Ne permet pas de visualiser remaniement équilibré : important à savoir !! Différents format de puces qui sont variables en fonction de la densité des régions qui vont être déposées sur la lame de verre. On utilise des logiciels qui calculent le relation de fluorescence. Qui réordonnent chaque des régions génomiques en classant chaque régions chromosomique du p vers le q. La deuxième du chr 2 du p vers le q  pour éviter tout biais lié à la technique. Donc les régions génomiques sont découpées et déposées de façon aléatoire sur la lame puis le logiciel va réordonner pour chacun des clones pour me les positionner du p vers le q et me classer les chromosomes. Puis calcul, utilisation de différents algorithmes pour visualiser gains ou pertes. Quand on va visualiser une différence de copies, du patient par rapport au témoins  variation du nombre de copies soit en perte soit en gain : but : perte ou gain (variation du nombre de copies) pathologique ou sans incidence pathologique ? Interprétation très complexe !

II-

Indications des différentes techniques en pathologies constitutionnelle

Indications en post natal      -

Caryotype conventionnel +/- FISH Période néonatale Susception syndrome clinique : phénotype typique ; par exemple trisomie 21 Ambiguïté sexuelle : malformation appareils génitaux externe  besoin d’identifier le sexe du nouveau-né (savoir si XY ou XX) Enfance adolescence : Recherche d’anomalies chromosomiques qui touchent chromosomes sexuels : retard pubertaire et croissance chez fille et chez garçon retard pubertaire et hypogonadisme Pathologies du a des cassures chromosomiques : anémie de Franconi : on voit phénotype caractéristique Adulte Infertilité Fausses couches à répétition Anomalies du spermogramme Caractérisation du nb de copies Enquête familiale (antécédents anomalies chromosomiques dans la famille) Indications cytogénétiques : Caractérisation d’un CNV observé sur ACPA (mécanique chromosomique) Evaluation des mosaïques cellulaires

 Puces à ADN - Bilan éthiologique d’un patient avec déficience intellectuelle isolé ou associée à malformations. - Bilan patient avec trouble du comportement du spectre autistique. - Si on veut préciser anomalie observer sur le caryotype.

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