Células madre mesenquimales PDF

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TEMA 4: CÉLULAS MADRE MESENQUIMALES (HMSC): BASES MOLECULARES DE SU ACTIVIDAD TERAPEÚTICA El contexto Se descubrieron en MO, pero hoy se sabe que se pueden obtener de todos los tejidos prácticamente. Actúa como soporte de tejidos. En el reino animal sobre todo y vegetal la vida está soportada con la muerte (cadena alimenticia). Dentro del organismo ocurre lo mismo. Hay un soporte de unas estructuras con otras. Esto hace que aparezca el concepto de homeostasis. Los órganos están íntimamente relacionados unos con otros. Todo este mecanismo genera un flujo complicado: todo está conectado. La homeostasis es frágil: -

-

La regulación al alza está relacionada con patologías. Si esto afecta al compartimento de las CM se genera predisposición al cáncer, displasia y que el cáncer se mantenga/disperse. A la baja también conlleva patología. SI afecta a CM podemos hablar de envejecimiento prematuro. Son raros pero severos. SI todo es exagerado puede haber un fallo orgánico porque el reservorio de células madre es mínima.

Por tanto, se intenta definir el marco de homeostasis que permite los organismos llevar una vida libre de patología. Con el paso del tiempo, se va deteriorando. En el centro de toda esta red podemos colocar la actividad de las células madres. El envejecimiento no tiene siempre las mismas consecuencias. Al analizar el órgano podemos ver que hay las mismas células madres, pero están deterioradas. Por ejemplo, hay una gran cantidad de células madres, pero su función está deteriorada.

Definiciones generales Terapia celular: una población de un donante se pone en cultivo ex vivo, se expande ex vivo, se realiza o no modificación genética, se fuerza la diferenciación y se reinplanta.

Cell isolation

Ex vivo Culture

Reimplantation

Differentiation Genetic modification??

Ex vivo expansion

Aunque esto sea general, cada CM es un mundo, no se puede generalizar nada. Incluso en grupos de pacientes: envejecimiento, drogas….

Células madre mesenquimales (MSC) Hoy en día se asumen que están en todos los sitios. Las que más se utilizan en clínica son las que se extraen de médula ósea (básicamente en declive por la complicación) y las de tejido adiposo. Se va a producir una proliferación, compromiso, progresión de linaje y diferenciación y maduración. En placa de cultivo (IN VITRO) no se ha comprobado que pueden generar distintos tipos celulares: - Osteocitos para regenerar hueso - Condrocitos para cartílago - Cardiomiocitos para el músculo cardiaco - Tenocitos para tratar lesiones de tendón - Célula de estroma. EL estroma es un elemento fundamental en todos los nichos para el mantenimiento de las células madre. EL estroma está muy mal definido. Es una población muy heterogénea. Está claro que en MO está relacionada con el mantenimiento a largo plazo de las células madre. Es fundamental. - Adipocitos con eficacia. Esto no se ha conseguido comprobar IN VIVO. No se sabe si estas propiedades se cumplen. Hay dos vertientes en la utilización de estas células en pacientes: - Células autólogas (del propio paciente). Ej: en diabetes se intenta controlar, aunque no va a curar, reformación de hueso en necrosis a vascular de la cabeza del fémur, pseudoartrosis de huesos largos, desórdenes tisulares musculoesqueléticas y conectivas Ej: Reconstrucción de huesos Ej: isquemia severa del miocardio Ej: Incontinencia urinaria. Estas células generan tipos celulares que aumentan la rigidez de los esfínteres. El ensayo clínico no consiguió demostrar una eficacia significativa Ej: fístula broncopleural Ej: Esclerosis múltiple Ej: Esclerosis lateral amiotrófica Ej: Remisión de colitis ulcerativa Son células con una capacidad de inmunoregulación importante. Normalmente reducen la inflamación. Por tanto, en patologías que cursan con inflamación como EM, estas células ayudan a controlar el foco de inflamación de las patologías. Por tanto, se pueden utilizar en procesos paliativos. - Células alogénicas (de distinto paciente). Hay patologías en las que no lo podemos hacer porque este proceso es más largo porque requiere estudio y comprobación. Hay que comprobar que las células no tienes mutaciones, modificaciones… EJ: indicaciones son básicamente las mismas

Planteamiento del problema En la mayoría de los ensayos clínicos no se han cubierto las expectativas abiertas por el trabajo básico/preclínico. ¿Por qué?!!

Aspectos básicos Se han podido infravalorar algunas condicionantes. Son capaces de generar, además de los nombrados anteriormente: endotelio vascular, neuronas y CV (favorecen la reparación mediante factores solubles y contacto con otras células). También son capaces de asociarse a tumores. Lo que se ha consolidado es su papel en inmunoregulación. El procedimiento: sea cual sea la célula, al obtener la biopsia obtenemos un millón o medio millón de células. Para que eso tenga algún tipo de utilidad hay que obtener 100 millones de células. Hay que expandir. Las condiciones de cultivo que se están aplicando son claramente mejorables. Se utiliza un suero artificial al 10-20%, glucosa alto 4,5mM y oxígeno a presión atmosférica 21%. Cada vez queda más claro que el 21% es hiperoxia, es decir, en el cuerpo tienen una concentración o presión de oxigeno menor. Ej: en cerebro 1%, en alveolos 12%. Estas son la mayor y la menor. Por lo que normoxia es 1-12%. Por eso, se quiso confirmar si esta presión alta de oxigeno estaba generando un estrés celular. Para ello: Se analizó si estas condiciones justificaban los fallos. Se observo que al 3 y 21 % en la curva de crecimiento era similar pero el 3 más. Si se analizaba en un punto concreto al principio se vio que la diferencia de las células crecidas al 3 y 21 porciento. La diferencia de crecimiento era de 50 veces mayor. Con sondas centromericas del cromosoma 17, 11 y 8 se vio si había cromosomas alterados. Se observaron algunas células con alteraciones en estos cromosomas Conforme pasaba el tiempo en cultivo había una mayor acumulación de células aneuploides (alteración de algún cromosoma normal, de los de antes). Al 3% siempre era menor que al 21% pero no había una diferencia muy muy grande. Esquema foto: las verdes son las buenas, amarillo: genéticas variaciones, rojo: células no viables con alteraciones cromosómicas. Se van eliminando del cultivo una gran cantidad de células. Por tanto, en el pase temprano se expanden las buenas, las no viables se eliminan. En el paso óptimo se obtiene una expansión sustancial siempre acompañada de unas pocas no viables. Esto no está relacionado con un riesgo potencial de generar tumores Expansión en función de la presión de O2 Al cultivarlas en 3% - Se reduce el estreés oxidativo - Se reduce la senescencia - Se reduce el acortamiento de telomeros El primer y tercer criterio están relacionadas con el envejecimiento del cultivo. Lo más importante fue ver la senescencia

El problema central de la senescencia La senescencia: las células envejecen y muchas alcanzan un nivel de inutilidad celular: eso es la senescencia. En ancianos hay una gran cantidad de células senescentes.

Diferenciacia de expresión Se estudio la expresión de genes al 3% y 21%. Se observaron alteraciones en la mitocondria: Al 21% de oxigeno esta inhibido el factor de trascripción HIF1alfa y altera la cadena mitocondrial (aumentando la respiración), generando más ROS que conlleva a una inestabilidad genética y senescencia. Si ponemos en una balanza el concepto de bioseguridad y riesgo: al 21% se disminuye la bioseguridad y aumenta el riesgo. Caracterización del patrón de expresión de miRNA en células hAdMSCs senescentes: Se hizo un estudio de que micro RNA estaban alterados en relación con el crecimiento. Se encontraron 42 miRNA bajo regulados y 42 up-regulados. De estos últimos, un 60% mapeaban en una región cromosómica concreta: región DLK1-DIO3.

14q32.2-14q32.31 ( 14q32.2

14q32.31 Rtlas

DLK1

snoRNAs

MEG3

MIRG DIO3

RTL1

200 Kb

Esta región tiene varios genes regulados epigeneticamente y el clúster más grande de microRNAs. ¿Por qué estas regiones estaba alterada por la senescencia? Conclusiones: Es una región importante por motivos: - Cuando se generan las IPS es la única región que presenta anomalías por modificaciones epigenéticas. Las células se quedan bloqueadas. Es una región muy compleja. En senescencia esta región está regulada. - Sus miRNA están regulados al alza - Esta región juega un papel dual ¿Cuál es la relevancia de este conocimiento? ¿Qué relación que existe entre calidad de células mesenquimales y resultados terapéuticos? El modelo que se hizo in vitro era un modelo de ratón en el que se induce un shock séptico. Con células mesenquimales humanas, los animales no morían. SI antes de pinchar las células se hacen senescentes, se modificaba el patrón, es decir, se anulaba la capacidad terapéutica de las células. Existe una relación directa entre senescencia de células mesenquimales y reducción de la actividad terapéutica. Se comprobó que había: -

Una pérdida de respuesta (mediada por mecanismos centrales de la célula como complejos AP1 de transcripción: FOS era eliminado.) Disminuye la migración.

¿Senescencia (SenM) como “predictor” de la actvidad terapéutica de las MSC in vivo? Condicionantes En todas estas aplicaciones hay que considerar 2 contextos en la variación de la respuesta terapéutica -Respuestas individuales: -Diferencias genómicas intrínsecas -Condiciones médicas y tratamientos previos -Las que tienen que ver con la expansión -Condiciones de cultivo específicas empleadas - consecuencias de condiciones de cultivo no fisilógicas EVALUACIÓN DE FACTORES INTRÍNSECOS Evaluación del papel de las hMSC en la reparación tisular Por ejemplo, se hicieron estudios para ver que miRNAs están afectados por la diferenciación de la célula mesenquimal tras inducirla. Se quiso ver si había un patrón de miRNA presente en indiferenciado y como consecuencia de la diferenciación se modulase. Es decir: tratar de identificar miRNAs presentes en el estado diferenciado de las hMSC y cuya expresión disminuye durante los primeros estadíos del proceso de diferenciación (Estos estarán implicados por tanto en el mantenimiento de la célula indiferenciada -> downregulation de estos miRNA = diferenciación) En estos estudios se diferenciaron células mesenquimales a adipocitos, osteocitos y se expansión normal. En condiciones basales solo había uno que tenía que downregularse para vivir: miR-335.

miR-335 is downregulated upon hMSC differentiation Si a células mesenquimales basales se le sobreexpresaba el miR-335, se bloqueaba la capacidad terapéutica: no podían proliferar ni ejercer inmunoregulación. Lo que hace es inhibir AP-1 porque inhibe FOS. Este microRNA es necesario que se downregule para que la célula sea terapéutica. A continuación, se intentó ver si había una correlación entre la cantidad de mi-r335 y capacidad terapéutica. Se vio que con la edad van subiendo los niveles de este mir-335 en células mesenquimales. Se cree que es un mecanismo de intentar mantenerlas, aunque funcionen peor. El que el mir-335 tenga una función optima depende de la cantidad heredada. Al aumentar la cantidad con la edad las células dejan de tener el mismo potencial, y se va produciendo senescencia. Esto hizo pensar que estaba implicado en un control de la senescencia y que conlleva en el tiempo a una ineficiencia.

Ejemplos relevantes de aplicación GvHD (GRaft vs Host disiese): Enfermedad del injerto contra el huésped. Se hizo un estudio retrospectivo. Ya se había hecho un ensayo. Se analizaron las muestras para ver si la hipótesis podía ser sólida. Los pacientes con enfermedad de injerto contra el huésped tienen un 42% una leucemia. SenM and the GvHD treatment!based on MSC transplant La administración de células mesenquimales se hizo a los más serios y se hizo un seguimiento del paciente en 4 años - Un 15-50% tenía una remisión total. - Un 80% tuvo respuesta clínica Por tanto, esto mejoraba a los pacientes. Se analizaron las muestras: microarrays y análisis bioinformático - Gr1: respondedores n=8 - Gr2: no respondedores n=3 Se analizaron bioinformaticamente los genes relacionados con senescencia anteriormente mediante arrays. Se hallaron unos marcadores relacionaos con el grupo 1 y 2. Resumen: se resumió en 3 genes mostraban tendencia a estar disminuido en el grupo no respondedor, aumentados en respondedor Además, se estableció que el gen PLEC estaba sobre expresado en no respondedor y downregulados los otros 3 (C8orf48, TRPC4 y ZNF14). Uno de los downregulados en los non-response era TRPC4, que si era un predictor dela eficiencia de las células mesenquimales. Era un canal no selectivo de calcio. Nada en la bibliografía lo relacionaba con la senescencia.

Conclusiones: -Los marcadores específicos (que se han establecido aquí) de pre-senescencia en expansión de células mesenquimales pueden predecir in vivo el potencial terapéutico -El TRPC4 se correlaciona con la eficacia de las Hmsc.

Conclusiones -

Las células mesenquimales humanas están influenciadas por condiciones de cultivo. Aquí lo hemos visto en oxígeno, por ejemplo. Esto condiciona su nivel de actividad y estabilidad genética - Las actividades terapéuticas están relacionadas con senescencia. - La senescencia de estas células es complicada, pero puede estar relacionada con un estudio de marcadores fiables o condiciones de cultivo para limitarlas. Hay que hacer un balance entre eficacia y bioseguridad.

Otros trabajos: del laboratorio a la clínica hMSCs para mejorar el cartílago hialino Cartílago articular y condrocitos humanos: Reparación articular Se utilizaron para mejorar cartílago hialino. ANTES: El procedimiento clínico realizado previamente era coger de la tibia una membrana de periostio y en la articulación se implantaba este periostio y se hacía un saquito rellenado con células condrocíticas diferenciadas y se cerraba. Los condrocitos articulares desdiferenciados (CAD) es una población de células humanas primitivas y heterogéneas muy similares fenotípica y funcionalmente con las células mesenquimales.

hMSCs para mejorar la cicatrizació espontánea? En el tratamiento de la fístula para su cicatrización espontánea con células mesenquimales (Expanded apidose-derived stem cells = Cx401) La hipótesis de estas células era que las células mesenquimales son cercanas a fibroblastos, generen más de ellos, más factores de crecimiento y cicatrice mejor. El resultado fue muy bueno. Con un solo tratamiento estuvo libre de fístulas durante varios años. Otra estuvo meses bien, pero volvió a aparecer. Se llegó a confirmar por primera vez en el mundo la efectividad de la aplicación terapéutica de este tipo de células con significación estadística....