Correction TD Genetique 2 bactérienne PDF

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Correction Travaux dirigés de génétique 2 bactérienne L2 sciences...

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TD#Génétique#2#–#Novembre#2016# !(Organisation!de!l’information!génétique!procaryote,!comparaison!de!génomes,!intérêt!de! la!présence!de!certains!gènes,!voir!de!leur!niveau!d’expression!pour!l’émergence!de!souches! pathogènes!)! ! I#–#Rappels#:#Organisation#de#l’information#génétique#chez#les#procaryotes## ! ! 5’#

3’#

3’#

5’#

+1#

RBS#/#SD#

-35# -10#

CDS!

Terminateur#Rho-indépendant#

Figure#1!:!Schéma!d’une!région!du!génome!bactérien!! (Attention! l’échelle!n’est!pas!respectée!concernant!les!distances!en!nucléotides!afin!de!simplifier!le! schéma)!

! Questions:## 1!-!Que!veulent!dire!ORF,!CDS,!RBS/SD! ORF$(Open$reading$frame)$:$Phase$ouverte$de$lecture$définie$par$la$portion$d’ADN$entre$2$codons$stop$ (TAA,$TAG,$TGA).$A$l’intérieur,$la$séquence$codante$(CDS$CoDing$Sequence)$est$bornée$par$un$codon$ start$ (ATG$ en$ général)$ et$ un$ codon$ stop,$ et$ est$ précédée$ d’un$ séquence$ de$ fixation$ du$ ribosome$ (RBS/SD).$Comme$les$introns$sont$rares$chez$les$bactéries,$CDS=gène$ !

5’! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! 3’! nnnnnnnnTGAnnnAGGAnnnnnnATGnnnnnnnnnnn…….nnnnnnnTAAnnnnnnnn! !

!!!!!!!!codon!

!!!!!!!codon!

!

!

!!!!!!!!!!!!codon!

!!!!!!!!!!

!!!!!!!!!stop!!!!!!!!!!!!!!SD!

!!!!!!!start! !

CDS#

!

!!!!!!!!!!!!!stop#

! !

!

#

!

!

!

#

!

#

#

!

! RBS/SD$:$ Ribosome$ Binding$ Site,$ ou$ séquence$ de$ Shine$ Dalgarno$ (spécifique$ des$ procaryotes)$:$ séquence$de$fixation$de$la$sous-unité$30S$du$ribosome$impliquant$l’appariement$entre$l’ARNr$16S$(de$ la$ s.u.$ 30$S)$et$ l’ARNm$ au$ niveau$ de$ la$ séquence$de$SD$ en$ amont$ du$codon$ AUG.$ Elle$ se$situe$donc$ dans$la$partie$5’UTR$(Untranslated$Transcribed$Region)$et$est$composée$de$4$à$6$nucléotides$parmi$la$ séquence$«$AGGAGG$» ,$placés$5-10$nucléotides$en$amont$du$codon$start.$$ $

!

!

ARNm!

! !

!

Chez$les$eucaryotes,$pas$de$SD$mais$il$existe$une$séquence$de$Kozak.$$

! ! ! 2!–!Où!démarre!et!s’arrête!la!transcription!?! +1$ jusqu'à$ terminateur$ rho-dépendant$ ou$ rho-indépendant$ (sur$ la$ figure$ rho-dépendant$ soit$ tigeboucle$suivie$d’une$séquence$riche$en$T$(sur$le$brin$codant)$donc$riche$en$A$sur$le$brin$transcrit$=>$poly$ U$ sur$ ARNm).$ La$ structure$ entraine$ une$ pause$ de$ l’ARNpol,$ et$ le$ plus$ faible$ $ nombre$ de$ liaison$ hydrogène$entre$A$et$U$(2$contre$3$entre$G$et$C)$$permet$le$décrochage$de$l’ARNm.$

! !

! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! !

! 3!-!Où!se!fixe!L’ARN!polymérase! sur$la$région$promotrice$(boite$-35$et$-10)$reconnue$par$le$facteur$sigma$$

!

! ! ! 4!-!Relier!les!noms!de!séquences!synonymes! ! Séquence!TATAAT! w! ! w Boîte!-10! Séquence!TTGACA! w! ! w Boîte!-35! Boîte!de!Pribnow! w! ! TATAAT$=$-10$=$Pribnow$ TTGACA$=$-35$

! 5!-!Le!brin!d’ADN!portant!la!séquence!«!ATG!»!!du!début! de!gène!(brin!sens)! correspond!au! brin!transcrit!par!l’ARN!polymérase.! Vrai!! ! Faux! ! Faux$!$le$brin$transcrit$est$l’antisens$

! !

! ! ! ! ! ! ! ! 6!Relier!les!synonymes! Brins!sens!! w! !

w

Brin!codant!!

! ! ! ! ! ! Brin!anti-sens! w! ! ! ! !

! ! ! !

w Brin!non!codant! w Brin!transcrit! w Brin!non!transcrit!! w Brin!matrice!

Brin$sens$=$brin$codant$=$brin$non$transcrit$ Brin$anti-sens$=$brin$non$codant$=$brin$transcrit$=$brin$matrice$

! 7!-!Ou!démarre!et!s’arrête!la!traduction!! Démarre$au$codon$d’initiation/de$démarrage/start$ de$la$traduction,$dans$la$grande$majorité$des$ cas$ AUG$(ATG$sur$le$brin$sens$de$l’ADN),$parfois$GUG$voire$UUG$$(GTG$ou$TTG)$$ Elle$s’arrête$à$un$des$3$codons$STOP$(TAA,$TAG,$TGA)$

! 8!-!Combien!de!protéines!sont!produites!à!partir!de!cette!région!nucléique!?! 5$

! 9!-!Combien!d’ARN!sont!transcrits!à!partir!de!cette!région!nucléique!?! 4$

! 10!-!Combien!d’ARNm!sont!transcrits!à!partir!de!cette!région!nucléique!?! 3$ ! 11!-!Combien!d’ARN!polycistroniques!sont!transcrits!à!partir!de!cette!région!nucléique!?! 1$

! ! II# -# Exercice# compréhension# d’un# travail# publié# dans# le# domaine# de# la# comparaison# de# génome#de#différentes#souches#bactériennes#pathogènes# ! ! Selon!les!travaux!de!Richter!et$al.!(2014)!EMBO!Mol!Med!6(12):!1622–1637.! Published!online!2014!Oct!31.!doi:!!10.15252/emmm.201404309!

! Mots!clés/glossaire!:!transfert!horizontal!de!gènes!via!un!prophage,!gènes!supplémentaires,! gène!surexprimé,!voies!de!signalisation,!inflammation,!SHU.!! EAEC!:!enteroaggregative!E.$$coli! EAEC!:!enteroaggregative!E.$$coli! SHU!:!syndrome!hémolytique!urémique! ! Contexte#:## Durant!l’été!2011,!une!épidémie! record!de!Escherichia$coli!«!entérohémorragiques!»!! a!frappé!l’Allemagne.!Cette!épidémie!due!à!une!souche! d’E.$coli$ est!une!effet!la!plus!grande! en!terme!de!nombre!de!personnes!touchées!(3842!personnes),!mais!également!du!fait!de!la! proportion! (>22%)! des! personnes! qui! ont! souffert! d’une! atteinte! reinale!sévère,! nommée! syndrome!hémolytique!urémique!(SHU)!(855!personnes),!nécessitant!une!hospitalisation.! 53! personnes!sont!décédées.!! Le!séquençage!du!génome!de!la! souche!«!LB226692!»! liée!à! l’épidémie! a!rapidement! révélé!que!cette!souche!appartenait!aux! E.$coli!entéro-agrégatives! (EAEC!:!enteroaggregative!

E.$ $ coli),! mais! qu’elle! était! capable! de! produire! une! shiga-toxine! typique! des! souches! entérohémorragique!(EHEC!:! enterohaemorrhagic$ E.$coli)! grâce!à! l’acquisition!par! transfert! horizontal!d’un!prophage! (DLP12)! portant!le!gène! stx!(gène!de!synthèse!d’une! shiga-toxine! habituellement!présent!dans!les!souches!d’EHEC)!! Les! souches! productrices! de! Shiga-toxine! sont! nommées! STEC!(pour! Shiga-toxinproducing! E.! coli)! et! peuvent! être! classées! en! fonction! de! leurs! antigènes! de! surface! (ex!:! O104:H4,! comme! pour! la! souche! épidémique! allemande,! ou! O157:H7,! comme! pour! des! souches!de!STEC!responsables!dans!le!monde!d’autres!épidémies,!de!moindre!ampleur)! Les! caractéristiques! du! génome! de! la! souche! O104:H4! allemande! ont! conduit! à! l’hypothèse!que!la!virulence!exceptionnelle!de!cette!souche!était!dû!à!la!combinaison!! • d’une! forte! adhérence! entre! elles! et! à! la! paroi! intestinale! (propriété! des! souches!d’EAEC!liée!à!un!plasmide!spécifique!des!EAEC)! • !et! d’une! production! d’une! shiga-toxine! bactérienne! Stx! responsable! d’atteintes!reinales!(propriété!des!souches!EHEC-STEC).!! Cependant,!les!chercheurs!ont!démontré!par!la!suite!que!les!propriétés!agrégatives! de!la!souche!n’étaient!pas!indispensable!à!la!virulence!de!la!souche!(7%!des!patients!atteints! hébergeaient! des! souches! ayant! éliminé! ce! plasmide)! ce! qui! laissait! ouverte! la! question!:! pourquoi! cette! souche! est! plus! virulente! que! d’autres! souches! de! E.$ coli! productrice! de! Shiga-toxine!?! Les!chercheurs!ont!également!notés!que!la!souche!allemande!de!O104:H4!possédait! une!forte!capacité!à!former!des!biofilms,!c’est!à!dire!des!structures!en!3D,!adhérentes!aux! supports! et! agglomérées! dans! une! matrice! d’exopolysaccharides! fortement! surproduite! dans!cette!souche!(expression!du!gène! pgaA!essentiel!à!la!production!de!l’exopolysaccharide! PGA!multipliée!par1000)! ! Les!chercheurs!ont!comparé!les!génomes!de!61!souches!d’E.$coli$choisies!parmi!des!souches! • non!pathogènes!de!laboratoire!(E.$coli!K12),!! • de!souches!d’E.$coli!non!pathogènes!et!commensales,!! • de!souches!d’E.$coli!pathogènes!de!différentes!origines!!(EAEC!de!type!STEC!O104:H4! apparentées/proches!de!la!souche!allemande,!ou!EHEC!de!type!STEC!O157:H7)! • et!2!souches!provenant!de!l’épidémie!allemande!! o la!souche!LB226692!dont!le!génome!a!été!séquencé!et!disponible,!! o et! la! souche! RKI! II-2027! désignée! comme! la! souche! de! référence! («!officielle!»)!de!l’épidémie!allemande!!! ! Ils!ont!repéré!un!gène!voisin!de!la!zone!d’insertion!du!prophage!DLP12!:!dgcX!qui!code!une! diguanylate! cyclase! impliquée! dans! des! voies! de! signalisation! bactérienne! impliquant! le! diGMP!cyclique!comme!messager!secondaire.!!!! ! Questions:## 1! -! En! quoi! la! souche! d’E.$ coli$ responsable! de! l’épidémie! allemande! de! 2011! est! un! bon! exemple!de!la!diversité!génétique!due!aux!transfert!horizontaux! Elle$doit$certaines$de$ses$capacités$à$l’acquisition$$ • d’une$part$du$gène$de$la$Shiga-toxine$stx$via$un$phage$(donc$transfert$horizontal$par$ transduction,$ici$localisée/spécialisée)$ • et$ d’autre$ part$ des$ gènes$ favorisant$ l’adhérence$ aux$ cellules$ intestinales$ et$ l’autoagrégation$via$un$plasmide$(donc$transfert$horizontal$possible$par$conjugaison)$

!

2!-!Qu’est!ce!qu’un!prophage! Matériel$génétique$d’un$phage$inséré$dans$le$génome$de$la$bactérie$(phage$en$«$cycle$lysogène$»)$

! Les! auteurs! tout! d’abord! observé! la! présence! du! gène! dgcX! ! dans! 3! des! 5! souches! qu’ils!ont!séquencés!(Figure!2A,! n°1-5)!au!niveau!de!la!région! attB!(région!voisine!du!gène! bioA,!bien!connue!comme!étant!le!site!d’insertion!du!phage!lambda)! ! 3!–!Que!pouvez!vous!proposer!comme!hypothèse!pour!l’acquisition!du!gène!dgcX!?! ! Il$ est$ probable$ que$ l’excision$ antérieure$ du$ phage$ DLP12,$ initialement$ inséré$ au$ voisinage$ du$ gène$ dgcX,$ a$permis$d’apporter$ce$gène$au$niveau$ de$son$site$d’intégration$dans$ E.$coli$:$la$région$ attB.$Le$ gène$serait$donc$arrivé$par$transduction$localisée/spécialisée$ Cet$événement$a$eu$lieu$chez$un$ancêtre$des$souches$O104:H4$(présent$chez$n°$2,$3,$4),$mais$pas$dans$ les$souches$O157:H7$(n°5)$

! Souches(( ( 1( ( 2( ( 3( ( 4( ( 5( ( ( 6( ( 7( ( 8( ( 9( ( 10( ( ( 11( 12( ( 11( 12( (

Région!attB!

! !

! ! ! ! Figure#2!:!Présence!ou!non!du!gène!dgcX!dans!différentes!souches!de!E.$coli$:!! A! 1!-!souche!W3110!:!souche!non!pathogène!d’E.$coli!K-12! 2!-!souche!55989!:!souche!EAEC!de!type!STEC!O104:H4!

3!–!souche!HUSEC041!:!souche!EAEC!de!type!STEC!O104:H4! 4!-!souche!LB226692:!souche!EAEC!de!type!STEC!O104:H4!liée!à!l’épidémie!allemande!de!2011! 5!-!souche!EDL933:!souche!de!référence!d’EHEC!de!type!STEC!O157:H7! ! B! 6!-!souche!2011C-3493!:!souche!EAEC!de!type!STEC!O104:H4!liée!à!l’épidémie!allemande!de!2011! séquencée!indépendamment!! 7!et!8-!souches!2009EL-2050!and!2009EL-2071!:!souches!EAEC!de!type!STEC!O104:H4!!proches!de! la!souche!allemande!et!provenant!d’une!épidémie!de!2009!en!Géorgie.!! 9!et!10!–!souches!d’E.$coli$entéro-toxiques!(isolats!E24377A!et!H10407)!! ! C! 11!–!souche!W3110!:!souche!non!pathogène!d’E.$coli!K-12! 12!–!souche!commensale!(non!pathogène)!SE11! !

Ils!ont!ensuite!cherché!la!présence!du!gène! dgcX!parmi!les!56!génomes!supplémentaires! disponibles!et!l’ont!retrouvé!dans!6!souches!sur!56!!(Figure!1BC,!n°6-10!et!12)! ! 4!-!Que!pouvez!vous!en!conclure!?! ! Le$gène$dgcX$a$été$retrouvé$$ • à$ la$ même$ position$ et$ flanquant$ le$ prophage$ DLP12$ dans$ 3$ souches$ supplémentaires$ très$ proches$de$celle$de$l’épidémie$allemande$(6-8),$$ • à$la$même$position$mais$flanquant$d’autres$prophages$dans$2$cas$de$souches$de$STEC$$ Cela$montre$ que$le$prophage$ DLP12$n’est$pas$ le$seul$ phage$responsable$du$ transfert$du$ gène$dgcX$ par$transduction$localisée$au$site$attB$$ $ De$ plus$ dgcX$ a$ été$ retrouvé$ également$ dans$ une$ souche$ commensale,$ là$ encore$ à$ côté$ d’un$ prophage,$dans$une$région$distincte$de$attB.$$ Donc$$ • cela$confirme$le$transfert$par$transduction$localisée$médiée$par$différentes$sortes$de$phages$ (pas$uniquement$DLP12),$que$ce$soit$au$site$attB$ou$ailleurs$(mais$dans$tous$les$cas$au$niveau$ d’un$site$d’insertion$de$phage).$ • Et$cela$montre$que$la$présence$du$ gène$dgcX$ n’est$pas$obligatoirement$liée$à$la$pathogénie$ (présence$dans$une$souche$commensale)$ $ La$ virulence$ de$ la$ souche$ allemande$ pourrait$ donc$ être$ le$ résultat$ de$ 3$ éléments$:$ le$ plasmide$ conférant$les$propriétés$d’autoagrégation,$le$gène$stx$codant$la$shiga-toxine$et$le$gène$dgcX.! !

Les! auteurs! ont! cherché! à! savoir! si! le! gène! dgcx! était! exprimé.! Pour! cela! ils! ont! construit! des! fusions! avec! le! gène! rapporteur! lacZ! (codant! la! ß-galactosidase)! et! les! ont! réintroduites!dans!le!génome!de!la!souche!W3110!(délétée!pour!lacZ).!La!figure!3!montre!les! mesures!d’activité!ß-galactosidase!ainsi!obtenues.!! ! 5!–!Pourquoi!la!souche!W3110!a!été!délétée!du!gène!lacZ$avant!l’introduction!des!fusions!?! Afin$que$les$mesures$d’activité$ß-galactosidase$soit$le$reflet$de$l’expression$du$gène$fusionné$avec$le$ gène$rapporteur!lacZ$et$non$le$reflet$de$l’expression$du$gène$endogène$lacZ.$

! 6! -! Quelle! différence! existe-t-il! entre! une! fusion! traductionnelle! et! une! fusion! transcriptionnelle!?!

! -$ Dans$ une$ fusion$ traductionnelle,$ le$ gène$ rapporteur$ est$ placé$ sous$ le$ contrôle$ des$ signaux$ de$ transcription$(promoteur)$et$de$traduction$(séquence$SD$et$codon$start)$du$gène$fusionné.$$ -$ Dans$ une$ fusion$ transcriptionnelle,$ le$ gène$ rapporteur$ est$ placé$ sous$ le$ contrôle$ des$ signaux$ de$ transcription$du$gène$fusionné$(mais$il$possède$ses$propres$signaux$de$traduction).$ $$

! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! Figure#3#:!Mesures!des!activités!ß-galactosidase,!après!une!nuit!de!croissance!en!milieu!riche! à!28!ou!37°C!,!de!souches!dérivées!de!la!souche!W3110,!délétées!du!gène!lacZ!et!portant!sur! leur! chromosome! des! fusions! traductionnelles! réalisées! entre! les! différents! gènes! codant! des!diguanylate!cyclases!de!E.$coli$et!le!gène!rapporteur!lacZ.!! ! 7!-!Que!pouvez-vous!déduire!de!la!figure!3!?!! ! Le$gène$dgcX$est$très$fortement$exprimé$(au$moins$10$fois$plus$que$les$autres$gènes$de$DGC,$à$28$ comme$37°C)$

! !

Chez! E.$ coli,! certaines! voies! de! signalisation! utilisant! le! diGMP! cyclique! produit! par! les! diguanylate! cyclases! contrôlent! la! production! de! structures! d’adhésion! que! sont! les! curli! (sorte!de!fimbriae!courbes).! Les!auteurs!ont!réalisé!différents!tests!phénotypiques!pour!mesurer!la!production!de!curli!et! de! cellulose! par! les! différentes! souches! d’E.$ coli$ de! leur! étude.! Ils! ont! conclu! à! une! surproduction!de!curli!dans!la!souche!allemande.!! Les! auteurs! se! sont! alors! intéressés! à! la! quantité! produite! de! la! protéine! régulatrice! de! l’expression!des!curli,!CsgD,!qui!est!un!activateur!de!transcription.!Les!résultats!obtenus!sont! reportés!dans!la!figure!4.! ! !

5( 2(

((((((3( (((4bis(

( (

4( 1(

! ! 1!-!souche!W3110!:!souche!non!pathogène!d’E.!coli!K-12! 2!-!souche!55989!:!souche!EAEC!de!type!STEC!O104:H4! 3!–!souche!HUSEC041!:!souche!EAEC!de!type!STEC!O104:H4! 4!-!souche!LB226692:!souche!EAEC!de!type!STEC!O104:H4!liée!à!l’épidémie!allemande!de! 2011! 5!-!souche!EDL933:!souche!de!référence!d’EHEC!de!type!STEC!O157:H7! 4!bis!-!RKI!II-2027!désignée!comme!la!souche!de!référence!(«!officielle!»)!de!l’épidémie! allemande!!! !

Figure#4# A! –! la! quantité! de! CsgD! produite! a! été! estimée! par! révélation! immunologique! à! l’aide! d’anticorps! anti-csgD! («!immunoblotting!»).! Les! croissances! bactériennes! ont! été! réalisées! sur!milieu!LB!agar!additionné!(LB)!ou!non!de!sel!(LBnoS)!pendant!5!jours!à!28°C!ou!37°C.!Le! témoin!CsgD!permet!de!donner!l’échelle!de!quantification!en!µg.! B!–!Quantité!de!CsgD!en!molécule/µg!de!protéines!totales!pour!chaque!souche!et!condition! de!croissance.!! !

!

8!–!D’après!la!figure!4,!que!pouvez-vous!conclure!quant!à!la!production!de!CsgD!à!28°C!dans! les!différentes!souches!bactériennes!?!Quel!rôle!peut-on!attribuer!au!sel!ici!?! ! Dans$5$ souches$testées$sur$6$(toutes$sauf$la$souche$5$(STEC$O157:H7))$ la$production$de$CsgD$est$plus$ forte$à$28$°C$qu$‘à$37°C,$elle$est$même$doublée$à$28°C$en$carence$de$sels$dans$le$(milieu$LBnoS).$$

! 9! –! Que! pouvez-vous! conclure! quant! à! la! production! de! CsgD! à! 37°C! dans! les! différentes! souches!bactériennes!?!! ! Dans$ ces$5$ souches$ testées$ la$ production$ de$ CsgD$ diminue$ à$ 37°C,$ mais$ peu$ pour$3$ souches$ 2,4$ et$ 4bis,$ alors$ que$ la$ diminution$ est$ très$ forte$ pour$ la$ souche$ sauvage$ (1)$ et$ la$ souche$ 3.$ Il$ existe$ un$ mécanisme$d’inhibition$de$la$synthèse$de$CsgD$à$37°C$qui$paraît$moins$efficace$notamment$chez$les$ souches$de$l’épidémie$allemande.$ Les$2$souches$de$l’épidémie$allemande$produisent$même$plus$de$CsgD$à$37°C$en$LB$qu’en$LBnoS.$$

! 10!–!A!votre!avis,!en!quoi!la!température!est-elle!un!paramètre!important!à!tester!dans!cette! étude!?!! ! C’est$ important$ pour$ évaluer$ la$ production$ de$ curli$ à$ l’extérieur$ et$ à$ l’intérieur$ du$ corps$ humain$ (37°C$!).$

! 11!-!Que!pouvez-vous!dire!de!la!production!de!curli!chez!la!souche!EHEC!?! ! Elle$est$très$faible,$même$à$28°C.$$

! 12!–!Outre!leur!importance!dans!l’adhésion,!sachant!que!les!curli!possèdent!une!structure! amyloïde! pro-inflammatoire,! quels! éléments! apportent! cette! étude! pour! comprendre! la! gravité!de!l’épidémie!allemande!?! ! L’inhibition$de$la$$production$de$curli$à$37°C$étant$partiellement$levée$dans$les$souches$responsables$ de$cette$épidémie,$les$curli$peuvent$favoriser$l’adhésion$des$bactéries$sur$des$supports$alimentaires,$ mais$aussi$être$surproduits$dans$le$corps$humain,$ce$qui$peut$entrainer$une$ réponse$inflammatoire$ importante$et$aggraver$certains$symptômes.$ La$ surproduction$ de$curli$combinée$avec$ la$production$ de$shiga-toxine$ont$ainsi$pu$conduire$aux$graves$syndromes$hémolytiques$urémiques$(SHU)$observés$ au$cours$de$cette$épidémie.!

! !...