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Evaluación de la cromatografía en capa fina y en columna. Grupo 13 †

Cesar Augusto Castro Vargas ([email protected]), Stalin José Manjarrez Castro ([email protected])

Resumen—En la práctica realizada el 8 de octubre de 2019 se llevó a cabo el análisis por cromatografía de capa fina y en columna de una muestra problema. Para el análisis de la muestra se utilizaron , según la serie eluotropica como fase movil, los disolventes éter de petróleo, MEC y metanol; como fase estacionaria silica y los colorantes rojo de metilo, m-nitroanilina, p-nitrofenol y azobenceno como patrón. Las medidas de velocidad (factor de retención) de cada compuesto (𝑅𝑠𝑡 de 100%) evidenciaron que la muestra era una mezcla de dos componentes (comprobado por la cromatografía en columna) que posiblemente eran azobenceno y rojo de metilo. Términos clave: Cromatografía en capa fina, cromatografía en columna, eluyente, fase móvil, fase estacionaria, serie eluotrópica, factor de retención. Abstract— In the practice carried out on October 8, 2019, the analysis by thin layer and column chromatography of a test sample was carried out. For the sample analysis, according to the eluotropic series as the mobile phase, petroleum ether solvents, MEC and methanol were used; as stationary phase silica and the dyes of methyl red, mnitroaniline, p-nitrophenol and azobenzene as standard. The velocity measurements (retention factor) of each compound (100% Rst) showed that the sample was a mixture of two components (checked by column chromatography) that were possibly azobenzene and methyl red. Key terms: Thin layer chromatography, column chromatography, eluent, mobile phase, stationary phase, eluotropic series, retention factor. I. INTRODUCCION El análisis de muestras complejas en diversos campos del conocimiento requiere de la aplicación de técnicas de separación especializadas que permitan ser selectivas a los compuestos a cuantificar. Entre estas técnicas está la cromatografía, la cual tiene distintas derivaciones todas siguen el mismo principio, la separación de los componentes de acuerdo con la naturaleza de sus interacciones intermoleculares [2]. Entre los distintos tipos de cromatografía se encuentra la de líquidos, en las cuales se incluye la de capa fina o TLC. La TLC es uno de los métodos más versátiles y sencillos para llevar a cabo análisis de muestras con un bajo costo, simplicidad, rápido desarrollo y alto grado de sensibilidad y reproducibilidad. La TLC es ampliamente usada en distintas industrias y campos de investigación como en la farmacéutica, el análisis clínico, toxicología, entre otros. Por otro lado, la TLC es una prueba preliminar para técnicas más especializadas como HPLC (cromatografía en columna), †

teniendo en cuenta que se puede evaluar el tipo de solvente a emplear como fase móvil y en consecuencia permite escoger el método y la columna adecuada [3]. Después de que una separación por medio TLC está completa, los compuestos se encuentran a determinadas distancias los cuales son un indicativo del grado de separación conocido como factor de retención. Por otro lado, en la caracterización de los compuestos, se debe escoger el solvente o la fase móvil adecuada para el proceso de elución del analito. Para este procedimiento, se debe analizar el tipo de interacciones de la fase estacionaria y el solvente, con el fin de estimar de forma cualitativa el grado de retención del compuesto a separar. Lo anterior se resume en analizar la serie eluotrópica para cada fase móvil (éter de petróleo, tolueno, diclorometano, MEC, acetato de isopropilo y metanol) y estacionaria (sílica gel). II.

METODOLOGIA

A. Procedimiento La descripción del proceso para realizar la cromatografía en capa fina y en columna se hará por medio de un diagrama de flujo como se muestra a continuación:

Figura 1. Der. Cromatografía en columna. Izq. Siembra de muestra (primer punto de la izquierda en ambas placas) y colorantes para cada solvente (primera palca de izquierda a derecha: rojo de metilo, m-nitroanilina; segunda placa de izquierda a derecha: p-nitrofenol, azobenceno)

Estudiantes Universidad Nacional de Colombia. Bogotá, octubre de 2019

Figura 2. Diagrama de proceso para la práctica experimental (Izq. Capa fina. Der. En columna)

B. Datos de entrada Para el desarrollo de la práctica se utilizaron solventes y colorantes específicos, los cuales tienen propiedades y características que se describen a continuación. Las condiciones de trabajo fueron: la presión atmosférica de 560 mmHg correspondiente con Bogotá y una temperatura ambiente de 20°C. ✓

Solventes empleados

Se presentarán las propiedades físicas más relevantes para cada solvente empleado ordenados de menor a mayor polaridad según la serie eluotropica.

2.

MEC

Tabla 3. Propiedades físicas MEC. MEC Propiedad Fuerza de elución en silica (ɛº) Punto de ebullición (ºC) Punto de inflamación (ºC) Densidad relativa Solubilidad en agua @20 ºC (g*L -1) Estructura

Valor 0,51 79,6 -4,0 0,805 292

Tabla 1. Serie eluotrópica de solventes para adsorción cromatográfica en silica [4] Solvent

Eluent strenght (ɛº)

Pentane

0.00

Hexane

0.01

Heptane

0.01

Trichlorotrifluoroethane

0.02

Toluene

0.22

1.

Chloroform

0.26

Dichloromethane

0.30

Diethyl ether

0.43

Ethyl acetate

0.48

Methyl t-butyl eter

0.48

Ethyl methyl Ketone

0.51

Acetonitrile

0.52

Acetone

0.53

Tetrahydrofuran

0.53

2-Propanol

0.60

Methanol

0.70

Éter de petróleo

Tabla 2. Propiedades físicas éter de petróleo. Éter de petróleo Propiedad Valor Fuerza de elución en silica (ɛº) 0,01 Punto de ebullición (ºC) >50 Punto de inflamación (ºC) -31 Densidad relativa 0,666 Solubilidad en agua @20 ºC (g*L-1) Inmiscible Estructura Mezcla de diferentes hidrocarburos líquidos

3.

Metanol

Tabla 4. Propiedades físicas metanol. Metanol Propiedad Fuerza de elución en silica (ɛº) Punto de ebullición (ºC) Punto de inflamación (ºC) Densidad relativa Solubilidad en agua @20 ºC (g*mL -1) Estructura

✓

Valor 0,70 64,5 9,70 0,792 Miscible

Colorantes empleados

Se presentarán las propiedades físicas más relevantes para cada colorante empleado. 1.

Rojo de metilo

Tabla 5. Propiedades físicas rojo de metilo Rojo de metilo Propiedad Valor Punto de fusión (ºC) 178-182 Densidad @ 20 ºC (g*mL-1) 0,791 Estructura

2.

m-Nitroanilina

Tabla 6. Propiedades físicas m-nitroanilina m-Nitroanilina Propiedad Valor Punto de fusión (ºC) 109-112 Densidad @ 25 ºC (g*mL-1) 0,9 Estructura

3.

p-Nitrofenol

Tabla 7. Propiedades físicas p-Nitrofenol p-Nitrofenol Propiedad Valor Punto de fusión (ºC) 110-114 Densidad @ 20 ºC (g*mL-1) 1,48 Estructura

Figura 3. Análisis éter de petróleo como disolvente

4.

Azobenceno

Tabla 8. Propiedades físicas azobenceno Azobenceno Propiedad Punto de fusión (ºC) Densidad @ 20 ºC (g*mL-1) Estructura

Valor 66-69 1,203

III. RESULTADOS Ya definidas las condiciones de trabajo (presión atmosférica de 560 mmHg, temperatura ambiente de 20 ºC, los disolventes a utilizar como primer análisis de la muestra problema del grupo 13, éter de petróleo, MEC, metanol y los colorantes a emplear, rojo de metilo, m-nitroanilina, pnitrofenol, azobenceno) se obtuvieron los resultados representados en las figuras 3, 4 y 5. Además, las mediciones se han realizado con un instrumento de medición de 30,00 cm ± 0,05cm.

Figura 4. Análisis MEC como disolvente

Tabla 9. Características sustancias con éter de petróleo Característica sustancias (± 0,1%) Altura solvente= 5,43 ± 0,05 cm Sustancia M 1 2 3 4 Altura (cm)

3,69

0,00

0,00

0,00

3,69

𝑅𝑓

68,0

0,0

0,0

0,0

68,0

36,9

0,0

0,0

0,0

36,9

ℎ𝑅𝑓

Característica muestra (± 0,1%) 𝑅𝑠𝑡(1)

---

𝑅𝑠𝑡(2)

---

𝑅𝑠𝑡(3)

---

𝑅𝑠𝑡(4)

100,0

Tabla 10. Características sustancias con MEC Característica sustancias (± 0,1%) Altura solvente= 5,79 ± 0,05 cm Sustancia M 1 2 3 4 Altura (cm)

5,44

5,44

5,79

5,79

5,79

𝑅𝑓

94,0

94,0

100,0

100,0

100,0

54,4

54,4

57,9

57,9

57,9

ℎ𝑅𝑓

Característica muestra (± 0,1%) Figura 5. Análisis metanol como disolvente Para el cada disolvente se tienen los resultados presentados en las tablas 9, 10 y 11, presentando la respectiva medida de velocidad (factor de retención , 𝑅𝑓 ) de cada colorante y los posibles componentes de la muestra, calculada como: 𝐷𝑖𝑠𝑡𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑟𝑒𝑐𝑜𝑟𝑟𝑖𝑑𝑎 𝑝𝑜𝑟 𝑙𝑎 𝑚𝑎𝑛𝑐ℎ𝑎 𝑅𝑓 = ∗ 100 𝐷𝑖𝑠𝑡𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑟𝑒𝑐𝑜𝑟𝑟𝑖𝑑𝑎 𝑝𝑜𝑟 𝑒𝑙 𝑒𝑙𝑢𝑦𝑒𝑛𝑡𝑒 Así mismo, como cada sustancia tiene un 𝑅𝑓 característico para cada sistema sorbente-eluyente, lo que permite su identificación, se presenta el valor de ℎ𝑅𝑓 , calculada como:

𝑅𝑠𝑡(1)

100,0

𝑅𝑠𝑡(2)

94,0

𝑅𝑠𝑡(3)

94,0

𝑅𝑠𝑡(4)

94,0

Tabla 11. Características sustancias con metanol Característica sustancias (± 0,1%) Altura solvente= 4,71 ± 0,05 cm Sustancia M 1 2 3 4 Altura (cm)

4,42

4,42

4,71

4,71

4,71

𝑅𝑓

93,8

93,8

100,0

100,0

100,0

44,2

44,2

47,1

47,1

47,1

ℎ𝑅𝑓 𝐷𝑖𝑠𝑡𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑟𝑒𝑐𝑜𝑟𝑟𝑖𝑑𝑎 𝑝𝑜𝑟 𝑙𝑎 𝑚𝑎𝑛𝑐ℎ𝑎 (𝑐𝑚 ) ℎ𝑅𝑓 = ∗ 100 10 𝑐𝑚 Y para conocer qué tipo de componentes posee la muestra, se calculará el termino 𝑅𝑠𝑡 , calculado como: 𝑅𝑠𝑡 =

𝐷𝑖𝑠𝑡𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑟𝑒𝑐𝑜𝑟𝑟𝑖𝑑𝑎 𝑝𝑜𝑟 𝑙𝑎 𝑚𝑎𝑛𝑐ℎ𝑎 ∗ 100 𝐷𝑖𝑠𝑡𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑟𝑒𝑐𝑜𝑟𝑟𝑖𝑑𝑎 𝑝𝑜𝑟 𝑙𝑎 𝑟𝑒𝑓𝑒𝑟𝑒𝑛𝑐𝑖𝑎

Este valor es frecuente encontrarlo en la literatura aplicando la relación: ℎ𝑠𝑡 =

ℎ𝑅𝑓 𝑠𝑢𝑠𝑡𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑝𝑟𝑜𝑏𝑙𝑒𝑚𝑎 ∗ 100 ℎ𝑅𝑓 𝑠𝑢𝑠𝑡𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑟𝑒𝑓𝑒𝑟𝑒𝑛𝑐𝑖𝑎

Se define: M: Muestra. 1. Rojo de metilo. 2. m-Nitroanilina. 3. p-Nitrofenol. 4. Azobenceno

Característica muestra (± 0,1%) 𝑅𝑠𝑡(1)

100,0

𝑅𝑠𝑡(2)

93,8

𝑅𝑠𝑡(3)

93,8

𝑅𝑠𝑡(4)

93,8

A partir de lo anterior, se concluye que la muestra problema es una mezcla de dos componentes (rojo y amarillo), entonces se lleva la muestra a la cromatografía en columna y utilizando como disolventes el éter de petróleo y el MEC se obtienen los resultados representados en la figura 6, 7 y 8.

Figura 6. Separación por cromatografía en columna de la muestra problema (Der. M1. Izq. M2)

Figura 8. Identificación fracción amarilla con éter de petróleo como disolvente y azobenceno como patrón.

Figura 7. Identificación fracción rojiza con MEC (der) y diclorometano (izq) como disolvente y rojo de metilo como patrón. De igual forma como se caracterizó anteriormente, se tiene ahora: Tabla 12. Características fracción rojiza. Solvente 1: MEC, Solvente 2: Diclorometano Característica sustancias (± 0,1%) Altura Solv1=3,83 ± 0,05 cm Altura Sol2 = 4,79 ± 0,05 cm Sustancia M2 M2 1 1 4 (Solv1) (Solv2) (Solv1) (Solv2) (Solv1) Altura 3,61 3,31 3,61 2,04 3,83 (cm) 𝑅𝑓 94,3 69,1 94,3 42,6 100,0 ℎ𝑅𝑓

36,1

33,1

36,1

20,4

Característica muestra (± 0,1%) 𝑅𝑠𝑡(1 𝑒𝑛 𝑆𝑜𝑙𝑣1)

100,0

𝑅𝑠𝑡(1 𝑒𝑛 𝑆𝑜𝑙𝑣2) 𝑅𝑠𝑡(4 𝑒𝑛 𝑆𝑜𝑙𝑣1)

162,2 94,3

38,3

Tabla 13. Características fracción amarilla en éter de petróleo. Característica sustancias (± 0,1%) Altura solvente= 4,39 ± 0,05 cm Sustancia M1 1 4 Altura (cm)

3,32

0,00

3,32

𝑅𝑓

75,6

0,0

75,6

ℎ𝑅𝑓

33,2

0,0

33,2

Característica muestra (± 0,1%) 𝑅𝑠𝑡(1)

100,0

𝑅𝑠𝑡(4)

---

Todos los análisis y discusiones pertinentes se realizarán en la sección de análisis de resultados. IV. ANALISIS DE RESULTADOS Una vez obtenidos todos los datos, son varios los posibles comentarios que se pueden hacer acerca de ellos, esto debido al comportamiento de la muestra problema y de los colorantes empleados con los solventes utilizados, ya que, con cada solvente, los colorantes y muestra arrojaron resultados muy llamativos que pueden permitir deducir patrones y además ayudar a predecir una buena metodología de trabajo.

Para comenzar, es importante mencionar que la polaridad de los solventes fue un factor fundamental para la obtención y variación de recorridos entre los colorantes y muestra presente, esto se apreció por medio de los datos obtenidos para los tres solventes, presentados respectivamente en las figuras 3, 4 y 8 respectivamente, donde se apreció que a mayor polaridad de solvente el recorrido iba a ser más mayor, como fue el caso del metanol, donde todos los patrones llegaron a la máxima distancia recorrida posible, y caso contrario con el éter de petróleo, donde la variación de los patrones fue casi nula a excepción del azobenceno (componente que no presenta ningún centro de polaridad y es una molécula simétrica). Con base en las figuras 4 y 5 (confirmado en la figura 6 con la cromatografía en columna) es acertado decir q ue la muestra problema estaba compuesta por dos componentes. Así mismo al observar a las figuras 3, 8 y los resultados en las tablas 9 y 13 (𝑅𝑠𝑡 de 100,0 %), se tiene que unos de los componentes era azobenceno. El segundo componente se afirma que es rojo de metilo, ya que al observar las figuras 4, 5, 7 y los resultados en la tabla 10, 11, y 12 (𝑅𝑠𝑡 de 100,0 %) se tiene que la tendencia d el recorrido es igual tanto en la muestra como en la fracción. En cambio, los colorantes restantes (pNitrofenol y m- Nitroanilina) no mostraron comportamientos similares en prácticamente ningún ensayo, siendo esto una causal de descarte para la muestra problema. Pero esta afirmación se deja a objeción ya que no es concluyente debido a los resultados de la figura 7 con diclorometano. Estos últimos resultados se pudieron deber a que fueron obtenidos días después de la experiencia inicial, donde se encontró la fracción rojiza evaporada casi en su totalidad, lo que ocasionó que se concentrara el rojo de metilo (el cual es un sólido apolar) y en consecuencia fuese arrastrado por la palca una mayor distancia que el patrón por el solvente poco polar.

Otro aspecto importante para considerar y que muchas veces pasa desapercibido es la saturación de la cámara cromatográfica, ya que ésta asegura que ambas fases (móvil y estacionaria) se encuentren en equilibrio y en consecuencia lograr la separación se logre con mayor facilidad. Lo anterior se evidencia en cada ensayo, donde la saturación se llevó durante un corto periodo de tiempo lo que generó que las manchas de los solutos quedasen alargadas y poco definidas en la dirección de la fase móvil. (Ver figura 9) V. CUESTIONARIO Cromatografía en capa fina 1.

¿Qué ocurre si al introducir la placa en la cámara cromatográfica, el nivel del eluyente alcanza el sitio de aplicación de la mancha? Si esto llegase a ocurrir, la o las sustancias de la mancha se diluirían en el eluyente y consecuentemente no ascenderían por la placa lo que implica que no tendría lugar la separación y la cromatografía fracasaría. 2.

¿Cuál es el efecto de la polaridad en la cromatografía? El principal factor para controlar el movimiento de los diferentes compuestos en un cromatograma es la polaridad del disolvente. El orden de elución del compuesto se incrementa al aumentar la polaridad de la fase móvil o eluyente. En general los solutos más polares quedarán más retenidos puesto que se adsorben más firmemente a los centros activos de la fase estacionaria, mientras que los polares se eluirán con mayor facilidad. 3.

¿Cuáles son las consecuencias de una columna mal empacada? Ya que del empaque depende la retención de la muestra y el volumen de elución, se obtendrían datos erróneos en la cromatografía. De igual modo si quedan espacios vacíos en la columna, puede ocurrir un estancamiento en la columna, obligando a que entonces se deposite todo el soluto a separar sobre un punto, dañando a la cromatografía. 4.

Figura 9. (1) sin cámara de desarrollo . (2) con cámara con saturación de 15-30 min. (3) con cámara con papel de filtro saturado de disolvente. (4) con cámara tipo S.

¿Cuáles son las diferencias entre cromatografía líquida y de gases? La diferencia principalmente radica en la fase móvil, ya que en la cromatografía líquida la fase móvil es un líquido y en la de gases es un gas. Además, la cromatografía líquida puede llevarse a cabo de diversas formas, mientras que, la cromatografía de gases necesita de una columna para ser llevada a cabo. Esto debido a que la retención de las partículas de gases se realiza principalmente por adsorción a una superficie, que bien puede ser física o química. La volatilización de los gases puede complicar la adsorción, así como de componentes que puedan condensar por perdidas de calor en la columna.

5.

Profundización sobre fluorescencia para sustancias incoloras. Si la sustancia sometida a cromatografía no es coloreada, se necesita de métodos especiales para su localización. Generalmente se emplea una lámpara ultravioleta o un revelador. La utilización de la lámpara UV se basa en el hecho de que muchas sustancias que son incoloras a la luz ordinaria presentan una fuerte fluorescencia a la luz ultravioleta. Las sustancias incoloras que no presentan fluorescencia se pueden detectar por otros métodos. Por ejemplo, un reactivo con el que los compuestos adsorbidos formen cierta coloración puede servir como revelador. Parámetros de la cromatografía líquida de alta eficiencia. La cromatografía de alta eficiencia o HPLC (high performance liquid cromatography), es una técnica de separación por adsorción que emplea una columna donde se encuentra la fase estacionaria constituida por partículas de diámetro muy pequeño (3 a 5 micrones). Los parámetros cromatográficos permiten tabular y comunicar los datos con mayor facilidad.

Figura 12. Tiempo de retención. Ancho de pico en la base Wb: Se obtiene trazando las tangentes en los puntos de inflexión a ambos lados del contorno de band a.

6.

Parámetros de las bandas individuales VM o V0: Volumen muerto o volumen extra columna. Es el volumen entre las partículas de fase estacionaria, más el volumen de la tubería y el detector. Es el volumen mínimo del eluyente que transporta a una sustancia no retenida por la fase estacionaria desde el punto de inyección hasta el detector.

Figura 13. Ancho de pico en la base Wb. 7.

En qué Orden (de arriba hacia abajo) se puede esperar encontrar los siguientes compuestos: naftaleno, ácido butírico, y acetato de fenilo en un gel de placa de TLC de sílice desarrollada con diclorometano. 1. Naftaleno, 2. Acetato de fenilo, 3. Ácido butírico. Este orden se debe a la polaridad del diclorometano. El naftaleno es el menos polar y el ácido butírico el más polar. 8.

Figura 10. Parámetros de las bandas individuales VM o V0. VR: Volumen de retención. Es el volumen que eluye de la columna desde la inyec...