Cromatografia en columna PDF

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Previo cromatografía...

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Investigación previa Práctica 6: Cromatografía en columna Objetivo: Utilizar la cromatografía como un método de separación de compuestos en una mezcla, además de utilizarla como posible método de purificación o identificador de éstos. Asimismo, entender lo que es la cromatografía en capa fina para poder llevar a cabo este procedimiento. • Define los siguientes términos: • Cromatografía: técnica de separación en la que los componentes de una muestra se separan en dos fases: una fase estacionaria de gran área superficial, y una fase móvil. • Fase móvil: Fase que se está moviendo en una dirección determinada. Puede ser un líquido o gas. La fase móvil se mueve a través de una columna que lleva la muestra a separar. • Fase estacionaria: Sustancia que se fija a la columna o en el panel, sobre cuya superficie se separan las sustancias. • Revelador: Son métodos visuales empleados para la localización de sustancias coloridas e incoloras y por consiguiente invisibles. Estos métodos se pueden clasificar en físicos y químicos. • Realiza una tabla que describa las características de compuestos que pueden ser empleados como fase móvil y fase estacionaria, así como ejemplos de sustancias químicas que pueden utilizarse, como fase móvil y fase estacionaria. Características del eluyente

Características del adsorbente

Poseer baja volatilidad sobre el soporte sólido. Valor del Rf con valor 0 Polar No polar Sólido Líquido o gas Sólidos muy porosos con capacidad adsorbente. Sustancias que pueden utilizarse como eluyentes

Sustancias que pueden utilizarse como adsorbente

Hidrocarburos saturados Hidrocarburos aromáticos Derivados de halógenos Éteres Cetonas Aldehídos Esteres Alcoholes Aminas Ácidos

Celulosa Sulfato cálcico (yeso) Gel de sílice (SiO2) Florosil Óxido de magnesio Alúmina (Al2O3) Carbón activado

• Métodos cromatográficos Cromatografía en columna: la fase estacionaria se introduce en una columna estrecha a través de la cual pasa la fase móvil por efecto de la gravedad o de una presión aplicada.Todas las cromatografías denominadas en columna se caracterizan por tener una fase estacionaria que se encuentra dentro de una columna de vidrio de 5 a 30 mm de diámetro por la que se hace pasar una fase móvil líquida o gaseosa que estará en permanente movimiento. Según la afinidad de las moléculas por la fase móvil o la estacionaria, éstas se separaran. El proceso de cromatografía de columna consta de una fase móvil (eluyente) y una fase estacionaria (adsorbente), los cuales dependen de las sustancias que se desean separar. Cromatografía de intercambio iónico: se basa en la afinidad de los iones en solución por los sitios de polaridad opuesta que se encuentran en la fase estacionaria. Cromatografía de exclusión: En la cromatografía de exclusión puede separarse moléculas solvatadas de acuerdo a su tamaño y habilidad a penetrar en una estructura tamiz (la fase estacionaria). Se lleva a cabo por diferencias en tamaño molecular y la habilidad de diferentes moléculas para penetrar los poros de la fase estacionaria a diferentes tamaños o magnitudes. La cromatografía de exclusión por tamaño se usa extensivamente para las separaciones preparativas de macromoléculas de origen biológico, así como para la purificación de polímeros orgánicos sintéticos. Cromatografía de adsorción: se basa principalmente en las diferencias en la afinidad relativa de los compuestos por el sólido utilizado como fase estacionaria. Las separaciones obtenidas se determinan casi exclusivamente por interacciones polares, siendo la fase estacionaria más

polar que la fase móvil. Cromatografía de partición: la fase estacionaria es un líquido soportado en un sólido inerte. La fase móvil puede ser un líquido (cromatografía de partición líquido-líquido) o un gas (cromatografía de partición gas-líquido, GLC). Cromatografía de fase reversa: el mecanismo de separación depende de interacciones hidrofóbicas entre las moléculas de soluto en la fase móvil y el ligando hidrofóbico inmovilizado en la fase estacionaria.

• ¿Cómo se prepara una columna? En cromatografía de fase líquida, la fase móvil es un líquido y éste desciende a través de la columna. La fase estacionaria es frecuentemente un líquido que recubre el interior de un tubo capilar o la superficie de partículas sólidas empaquetadas dentro de la columna. Alternativamente, las mismas partículas sólidas pueden ser la fase estacionaria en cualquier caso, el reparto de solutos entre las fases móvil y estacionaria dan lugar a la separación. Las columnas pueden ser empaquetadas o de tubo abierto. Una columna empaquetada se llena con partículas que contienen la fase estacionaria y los materiales más usados para los tubos de las columnas son de acero inoxidable y de vidrio, siendo el primero preferido por la manipulación más fácil. Para el caso de la columna de tubo abierto, se trata de un capilar hueco estrecho con la fase estacionaria cubriendo las paredes interiores. En las columnas empaquetadas, el soporte debe ser un sólido poroso con gran área superficial, inerte y con una buena resistencia mecánica. Los compuestos empleados para empaquetamiento varían, entre los cuales podemos encontrar: tierra de diatomeas, alúminas, resinas de intercambio iónico o compuestos de sílice como SiO2 amorfo, sin embargo, éste debe de someterse a un tratamiento para hacerlo aún más inerte y que pueda ser empleado sin problemas. Es característico que el tamaño de las partículas y de los poros deben ser lo más uniforme posible. El procedimiento del empaquetado es muy sencillo y se resume en los dos siguientes pasos: • Colocación de la fase estacionaria y/o compuestos de empaquetamiento de manera uniforme y compacta en la columna (longitud y diámetro apropiados).

• Verificación de ausencia de espacios vacíos en la columna (para evitar que los picos del cromatograma sean más anchos y de menor eficiencia). Una vez que la columna se encuentra correctamente empaquetada, se procede a la aplicación de la disolución de la muestra. Cuando se introduce en la columna cierta cantidad de muestra, ésta se queda en una zona de cierta altura en la columna. Si entonces se introduce el disolvente, comienza el desplazamiento de la zona a lo largo de la columna. La parte superior de la zona se disuelve poco a poco y, empujado por la disolución que se forma, el frente de la zona avanza hacia la base de la columna. Si el disolvente utilizado para la elusión es el mismo que la disolución problema, los platos teóricos comprendidos en la parte central de la zona, reciben una fase móvil en equilibrio con ellos y las concentraciones permanecen estacionarias. El movimiento de la zona sólo es aparente en sus extremos por lo que su estudio se puede hacer sobre una zona que se supone no tiene más espesor de un plato teórico. La diferente capacidad de los distintos disolventes para eluir un determinado soluto es prácticamente independiente de la naturaleza del soluto. Se puede describir la elución como el desplazamiento de un soluto de la fase estacionaria por un disolvente. Para el caso específico de cromatografía de adsorción, existe una ordenación de los disolventes de acuerdo a su capacidad relativa para desplazar solutos de un determinado adsorbente, llamada serie eluotrópica. La fuerza eluyente es una medida de energía de adsorción del disolvente, supuesto valor cero para el sistema pentano/sílice pura. Cuanto más polar es el disolvente, mayor es su fuerza eluyente respecto a la sílice en cromatografía de adsorción. Cuanto mayor es la fuerza eluyente del disolvente, tanto más rápidamente se eluirán los solutos de la columna. • Tipos de reveladores y ejemplos • • • • • • •

Luz ultravioleta, como los fotómetros de filtros con una lámpara de mercurio como fuente. Fluorescencia Infrarrojo Índice de refracción Dispersión de luz (ELSD) Espectrometría de masa. Detectores de arreglos de diodos.

• Propiedades de reactivos y productos

Reactivo

Estructura

Peso molecular

Estado físico

Acetato de etilo

88,106 g/mol.

Líquido incoloro claro. Característico de los éteres, semejante al olor de la piña.

Ácido perhidro benzoico

122,12 g/mol

Sólido incoloro

4-aminobenzoat o de etilo

165,19 g/mol

Sólido incoloro a blanco. Inodoro.

9-fluorenona

180.21 g/mol

Polvo sólido amarillo; inodoro

Hexano

86.17 g/mol

Líquido incoloro con un olor parecido al del petróleo.

Acetona

58.08 g/mol.

Líquido incoloro. Olor característico agradable. Volátil. Altamente inflamable y sus vapores son más pesados que el aire.

Yodo

Acetato de etilo

Masa atómica: 126,90447 u

Sólido lustroaso de color azulnegro.

Punto de fusión

Punto de ebullición

Densidad

-83 °C

77 °C

900,3 g /cm³ a 20 °C

Ácido perhidro benzoico

122 °C

249 °C

1,32 g/cm³

4-aminobenzoat o de etilo

88-90°C

310 °C

Densidad a granel a 20°C: 320 kg/m³

9-fluorenona

81 - 85 °C

342 °C

0.9 g/cm³ a 20 °C

Hexano

-95.6°C

69°C

0.66 g/ml a 20°C

Acetona

-94°C.

56.5°C

0.788 g/ml a 25°C; 0.7972 g/ml a 15°C

Yodo

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113,7°C

183°C

4,94 g/ml

Pka

Solubilidad

Código de

colores Acetato de etilo

16 – 18 a 25 ºC.

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Ácido perhidro benzoico

solubilidad en agua 8,7% P/P a 20°C soluble en etanol,acetona,cl oroformo, éter etílico.

En agua a3,4 g/l a 20°C

4-aminobenzoat o de etilo

3.5

9-fluorenona

10.81±0.20

Insoluble en agua

Hexano

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Miscible con etanol, acetona, benceno y éter dietílico.

Solubilidad en agua 3,82 g/l a 37 °C Soluble en muchos disolventes orgánicos.

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----

Acetona

19.3

Yodo

Miscible con agua, alcoholes, cloroformo, dimetilformamida, aceites y éteres

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En agua es de 0.029 g/100 ml y en diclorometano es de 2,91 g/100 ml.

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