Cunatificacion de azucares (Bioquimica)-1 PDF

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2 DETERMINACION DE CARBOHIDRATOS TOTALES PORESPECTROFOTOMETRIA UV (METODO DE FENOL-SULFURICO)INTRODUCIONEl método por espectrofotometría UV hace referencia al uso de la luz para medir las concentraciones de ciertas sustancias químicas. Para que este fenómeno pueda llegar a medirse se debe tener pres...

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2.1 DETERMINACION DE CARBOHIDRATOS TOTALES ESPECTROFOTOMETRIA UV (METODO DE FENOL-SULFURICO)

POR

INTRODUCION El método por espectrofotometría UV hace referencia al uso de la luz para medir las concentraciones de ciertas sustancias químicas. Para que este fenómeno pueda llegar a medirse se debe tener presente la concentración de las especies absorbentes dado a que esta es proporcional a la absorbancia según la ley de lamber-beer donde: A=e×b×c * A= es la absorbancia (magnitud adimensional) * e= es un coeficiente de proporcionalidad denominado coeficiente de extinción molar. Indica la absorbancia de una determinada sustancia a una longitud de onda dada y se expresa en M-1 .cm* b es el ancho o espesor de la celda donde se deposita la muestra y se expresa en cm. * c es la concentración expresada en moles / Litro (M) FUNDAMENTO La reacción de color para medir la concentración de carbohidratos solubles por espectrofotometría se basa en la utilización del método colorimétrico de fenol-sulfúrico que depende de la deshidratación de sacáridos derivados de hidrolisados a furfural que transcurre en el proceso de la reacción. Los derivados del furfural con las formas del fenol coloreado absorbe la luz en el rango visible a una longitud de onda de 490 nm. Reacción: FENOL+ H2SO4 (concentrado) + CARBOHIDRATO

→

HMF (amarillo naranja)

Para hexosas (hidroximetil furfural) Para pentosas (metil furfural)

METODOLOGIA Preparación de la muestra A 2 ml de alícuota de una solución de hidratos de carbono (muestra problema) se mezcla con 1 ml de solución acuosa al 5% de fenol en un tubo de ensayo. Posteriormente, se añade 5 ml de ácido sulfúrico concentrado rápidamente a la mezcla. Luego los tubos de ensayo se dejan en reposo durante 10 min, se agitan durante 30 segundos y se colocan durante 20 min en un baño de agua a temperatura ambiente para el desarrollo de color. El blanco y la solución patrón se preparan conforme al procedimiento anteriormente descrito, utilizando el carbohidrato de interés. Finalmente se lleva a una celda donde se deposita en el espectrofotómetro

para programar la longitud de onda a 490 nm y se procede a leer la absorbancia (M. DuBois, K. Gilles, J. Hamilton, P. Rebers y F. Smith, 1956).

PREPARACIÓN DE LA CURVA PATRÓN

Se procede a determinar las diferentes concentraciones del carbohidrato partiendo de 0.01 % que indica 0.1 gramos en 1000 ml de agua. Posteriormente se toman alícuotas de 0.1; 0.2; 0.3 y se completa a volumen para 1.0 ml con agua destilada. Por último se añade el fenol y el ácido sulfúrico siguiendo la metodología anterior, para ser leídas en el espectrofotómetro (R. Matissek, F.M. Schnepel y G. Steiner, 1992).

Tabla 1: Preparación de las soluciones patrones para elaborar una curva patrón.

RESULTADOS Para leer los resultados de la muestra a analizar, es necesario construir una curva de calibración o curva patrón a diferentes concentraciones con el carbohidrato de interés (disacáridos y monosacáridos) para determinar la absorbancia. Para calibrar el espectrofotómetro se procede a ubicar el blanco que se tiene provisto en la celda, ajustándolo al 100% de transmitancia y 0,000 de absorbancia. Una vez obtenida la absorvancia de cada concentración, se grafica sobre excel o una hoja de papel milimetrado absorbancia vs concentración de cada solución preparada. La ecuación

de linealidad que arroje la gráfica de la curva patrón se tomara como referencia para hallar matemáticamente la concentración del azúcar presente en la muestra. Luego se procede a medir la absorbancia de la muestra de interés. Entonces: Se tiene que Y= mx+b (ecuación de linealidad expresada en la curva patrón) Donde: Y es la absorbancia del analito. m. es la pendiente (valor numérico) que tomo de la ecuación de linealidad de la curva patrón. x, es el dato que no conozco. b, es el intercepto (valor numérico) que tomo de la ecuación de linealidad de la curva patrón.

Teniendo en cuenta los datos de la ecuación lineal despejamos X (lo tomamos como concentración del analito). Como obtenemos la concentración diluida en ppm se realizan los cálculos necesarios para determinar la concentración en gramos de la muestra analizada en determinado alimento. O de igual manera la absorbancia que obtenemos cuando medimos la muestra se interpola o extrapola en la gráfica según el valor arrojado.

Extracción de fructosa Procedimiento 1) Pelar la fruta 2) Cortarlas en trozos pequeños y masar 100 gramos de manzana. 3) Con los trozos se procede a pasarlas por una juguera o mortero para obtener así la fruta procesada. 4) Colocar la fruta en 50 gramos de agua caliente y dejar mezclar durante 60 minutos en un baño a 70 °C haciendo así que la fructosa se disuelva en el solvente polar que es el agua, obteniendo así una mezcla.

Preguntas para el pre-informe 1- Escribir las fichas de seguridad de los reactivos químicos. 2- Escribir el proceso de ciclación de la fructosa, (mecanismo de ciclación) 3- Escribir las reacciones envueltas en la producción del complejo coloreado esperado (reacción de producción del HMF-Fenol). 4- Que funciones bioquímicas cumplen de los monosacáridos? Preguntas del informe 1- Escribir y discutir el mecanismo de reacción completo según la tesis enviada (En la tesis no están planteados los pasos completos, así que ustedes tendrán que completarlos, leer de paginas 1- 15, tengan en cuenta que en esta tesis solo se discute la primer reacción, formación de HMF, y la segunda reacción les toca plantear el mecanismo a ustedes, revisen las notas del tema de aromáticos del semestre pasado y discutan que tipo de activador es el grupo [– OH], orto, meta o para? Y planteen el mecanismo TODO para este último paso lo tiene en sus cuadernos).

2- Realizar la curva de calibración, con los datos del lab. 3- Hallar la concentración de la fruta problema de todos los grupos. 4- Comparar los datos obtenidos con los datos de la literatura....