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DETERMINACIÓN DE AZUCARES REDUCTORES POR EL MÉTODO DNS (Acido 3,5-dinitrosalicilico) Figueroa Rojas Carlos, Moreno Bustamante Omar, Serna Arango Mabel Universidad de Córdoba

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     PECHI MIRA ESTE EJEMPLO

1. CALCULOS 1.1 Solución madre.  1 g de glucosa anhidra en 1000 ml de agua destilada. 1.2 Dilución de la muestra para establecer una escala estándar de 0 a 1000 ppm de glucosa. Para determinar la concentración de azúcares reductores se debe realizar una curva de calibración que relacione la concentración de los azucares y la absorbancia, para ello se agregó a cada muestra lo reportado por la tabla 1. Tabla 1. Escala estándar. Tubo

ml.

de

T1 T2 T3 T4

estándar 0.0 0.2 0.4 0.6

solución ml.

de

destilada 1.0 0.8 0.6 0.4

agua Concentración final (ppm) 0 200 400 600

T5 T6

0.8 1.0

0.2 0.0

800 1000

A partir de las diluciones anteriores se toma 1 ml de cada muestra y se le agrega 1 ml de agua junto con 1ml de DNS (incluyendo la muestra problema). Tratamientos posteriores.  Agitación  Ebullición por 5 minutos  Enfriamiento  Adición de 8 ml de agua destilada 2. RESULTADOS 2.1 Tabla 2: Medida de absorbancia para cada dilución Tubo Absorbanci

T1 0

T2 0,076

T3 0,195

T4 0,336

T5 0,439

T6 0,553

a 2.2 Gráfica 1: Curva de calibración Concentración vs absorbancia.

Tp 0.256

Concentracion vs absorbancia Absorbancia a 575 nm

0.6 0.5 0.4

f(x) = 0.04 x + 0.06 R² = 0.18

0.3 0.2 0.1 0

0

1 f(x) R² ==00 2

3

4

5

6

7

8

Concentracion en ppm

La curva de calibración permite relacionar la absorbancia medida con la concentración de los azúcares. Seguidamente se realizó regresión lineal con el fin de a través de una ecuación lineal (Y=Mx+b) relacionar la pendiente y el intercepto y de esta manera calcular la concentración de la solución problema (como se explica seguidamente). Se debe notar que el R2 que se obtuvo es bastante cercano a 1. 2.3 Calculo de la concentración de la solución problema.  Haciendo uso de la ecuación obtenida en la curva de calibración y conociendo el dato de absorbancia de la solución problema, se puede estimar la concentración de la solución problema.  Se tiene que Y = mX + b Donde: Y = absorbancia de la muestra problema m = pendiente b = intersecto Parámetros

Valor

Y

0,256

m

0,0006

b

-0,0189

 Resolviendo la ecuación para obtener la concentración de la solución problema. X=

Y −b m

X=

0,256− ( −0,0189) = 458,166667 ppm. 0,0006

3. ANÁLISIS A medida que la concentración de las soluciones aumentaba, el nivel de absorbancia medido a una longitud de onda de 575 nm también lo hacía, resultado que ya se esperaba por la relación directamente proporcional entre ambos parámetros. Por esto, se puede decir las concentraciones son un buen indicador de que

la ley de Beer y 2

Lamberty se cumple. En dicha curva de calibración se observa un R de 0,9952 lo que indica un buen ajuste de los datos tomados, se infiere que el proceso se llevó a cabo de manera adecuada pues son los resultados esperados, lo más cercano a uno. La importancia de realizar dichas diluciones radica en esta ley solo es aplicada en bajas concentraciones como una forma de garantizar la linealidad en la curva de calibración y no tener que realizar extrapolaciones. Los resultados más cercanos a la concentración de la muestra problema los tuvieron los tubos 3 y 4, con una diferencia de 0,61 y 0,8 respectivamente. A ciencia cierta no se puede saber a qué podría deberse, pero se infiere que hubo mala manipulación por parte de los estudiantes, mala dilución, calibración de la pipeta, falta de práctica, entre otros. Los azucares reductores poseen un grupo carbonilo libre formando un grupo hemiacetal (molécula que contiene un grupo hidroxilo -OH y un residuo alcóxido -OR unidos a un mismo átomo de carbono) que le permite reaccionar con el DNS, el cual a su vez tiene

la capacidad de oxidar esos azucares provocando resultados colorimétros que se midieron con una longitud de onda de 575 mn porque tiene una amplia absorción, se toma de base el estudio realizado por Gómez et al, 2010 en donde los análisis se hicieron desde una longitud de onda de 500 hasta 700, resultando la mayor absorción en la de 575 nm Al aplicar la técnica DNS, se pudo determinar que la mayor cantidad de azúcares se encontraba en la muestra 6 (T6), esto es bastante congruente puesto que esta muestra no se le agregó agua destilada, es decir la muestra no se diluyó. Lo que ocurre es que en disolución alcalina, el azúcar se hidroliza produciendo un compuesto que se reduce a un grupo nitro del DNS, para dar un producto monoamino, dentro de los sustratos sobre los que se actúa el más significativo es, sin duda, la sacarosa, en donde actúa una enzima llamada sacarasa. Los productos de reacción se detectaron espectrofotométricamente tras su conversión en derivados coloreados. En concreto, la extensión de la hidrólisis enzimática de sacarosa (azúcar no reductor) en glucosa más fructosa (azúcares reductores) valorándose a partir del método de ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS), el cual se basa en la reducción del DNS (de color amarillo) por la glucosa u otro azúcar reductor al ácido 3-amino-5-nitrosalicílico (de color rojo ladrillo) (Chaplin, 1986), cuya presencia puedo detectarse por lectura de la Absorbancia en la zona de 575 nm. La reacción que se lleva a cabo es la siguiente:

La hidrólisis no es más eficiente al incrementar la temperatura o generar agitación no funcionan como catalizadores significativos en la reacción, por lo cual se infiere que el proceso fue producto de la reacción de la materia prima y los compuestos presentes

comparando estos resultados con los obtenidos en una investigación realizada por Cortes et al, en 2013 se haya similitud en los resultados.

4. CONCLUSIONES La técnica de colorimetría denominada DNS permitió determinar azúcares reductores, en donde la concentración de azucares está relacionada de acuerdo a la teoría con la intensidad del color resultantes (Cortes et al, 2013). EJEMPLO CAMBIA NO COLOQUES LO MISMO Con esta práctica pudimos determinar de manera cuantitativa la concentración de azucares en determinadas muestras con concentraciones conocidas para poder realizar la gráfica, concentración Vs absorbancia, los datos se ajustaron obteniendo un R 2 de 0,9952 Teniendo en cuenta que el R2 es mayor a 0,95 y los datos no tienen mucha dispersión, por lo tanto son aceptables. Los azucares que reaccionan se llaman azucares reductores, que pueden unirse de forma inespecífica a otras moléculas; los que no lo hacen, azucares no reductores. El método DNS es una técnica colorimétrica que emplea 3,5-ácido dinitro salicílico para la hidrólisis de polisacáridos presentes en una muestra, seguido de la determinación espectrofotométrica a 575 nm de los azúcares reductores. Así comprobamos también que la espectrofotometría es el método de análisis óptico más adecuado para la determinación de una concentración en una muestra. Dicho de otro modo es un instrumento que permite comparar la radiación absorbida o transmitida por una solución que contiene una cantidad desconocida de soluto, y una que contiene una cantidad conocida de la misma sustancia en este caso la glucosa. Los azúcares reductores son aquellos azúcares que poseen su grupo carbonilo (grupo funcional) intacto, y que a través del mismo pueden reaccionar como reductores con otras moléculas. La glucosa es el azuzar reductor más abundante en el organismo (Toledo 2013). Hoy en día la industria alimentaria utiliza varios tipos de métodos analíticos para la determinación de azúcares en los diferentes productos y/o bebidas a utilizar como medio de venta. Uno de los métodos más acordes y con mejor resultados en la determinación de los azucares con carácter reductor, es el método ácido 3,5 dinitro salicílico (DNS). El DNS reacciona únicamente con los azúcares reductores. La

sacarosa es un disacárido no reductor, pero tras su hidrólisis en medio ácido se liberan glucosa y fructosa que sí son reductores y reaccionan con el DNS generando un producto coloreado. La intensidad del color, que se puede medir por métodos espectrofotométricos es proporcional a la concentración de sacarosa. El presente informe desarrollara el procedimiento respectivo para la determinación de azucares reductores a partir de una solución patrón de glucosa, que permitió realizar y ajustar una curva de calibración, y una solución desconocida; por el método DNS (Guzmán et al. 2013).

5. CONSULTA 1. Consulte otros métodos utilizados para la determinación de azucares reductores y glucosa ¿Qué ventajas y desventajas presentan para su uso en biotecnología? R//: Una amplia variedad de métodos se han utilizado para determinar azucares reductores, todos estos han sido variaciones del método de Fehling. Estas variaciones se han dado para los diferentes tipos de alimentos, con esto ha conseguido

mejorar la

precisión de reducción y eliminar cualquier factor que interfiera con la producción de óxido de cobre, entre estos la alcalinidad del reactivo, la proporción, el tiempo de calentamiento, la concentración del azúcar, entre otros. Entre estos métodos de determinación de azucares tenemos.  MÉTODO DE FEHLING  MÉTODO DE MUNSON WALKER  METODO DE SOGOMY I-NELSON  DETERMINACION DE GLUCOSA POR EL METODO FLUORIMETRICO  METODOS ENZIMATICOS.  MÉTODO DE LANE Y EYNON, entre otros. REACCION DE FEHLING: Se trata de una reacción redox en la que el grupo aldehído (reductor) de los azúcares es oxidado a grupo ácido por el Cu2+ que se reduce a Cu+. Tanto los monosacáridos como

los disacáridos reductores reaccionan con el Cu2+ dando un precipitado rojo de óxido cuproso. La reacción tiene lugar en medio básico por lo que es necesario introducir en la reacción tartrato sódico-potásico para evitar la precipitación del hidróxido cúprico. La prueba de Fehling no es específica; otras sustancias que dan reacción positiva son los fenoles, amino fenoles, benzoína, ácido úrico, catecol, ácido fórmico, hidrazobenceno, fenilhidrazina, pirogalol y resorcinol. (Herrera 2001)

Método Automático Del Ácido Cúprico: Consiste en la extracción de azucares de la muestra con etanol, luego este se evapora, seguidamente el residuo se disuelve en agua; los azucares en solución reaccionan con picrato formando picramida la cual se mide colorimétricamente. En caso de tratarse de sacarosa esta debe ser previamente tratada con invertasa dializándola. Ventajas: •

Puede aplicarse a muestras que contengan solo lactosa.

•

Puede medir otros azucares que estén presentes, además de glucosa, fructosa.

Desventajas: •

Las concentraciones de glucosa y/o fructosa y sacarosa presentes en la muestra

deben ser menores al 10%.

Método de Tollens: El reactivo de Tollens contiene el ion plata en forma de complejo amoniacal, dicho ion se reduce a plata metálica, formando un espejo de plata en presencia de aldehídos que se oxida hasta su correspondiente ácido que forman a su vez las sales. Ventajas:  Es más sensible que el de Fheling y más adecuado para revelar pequeñas diferencias de actividad.

Desventajas:  Es menos eficaz en la diferenciación de azúcares reductores y no reductores

Método Reductometrico De Luff-Schoorl Los azucares presentes en la muestra se hacen reaccionar con una solución carbonatada alcalina de concentración conocida de iones cobre (II) calentando a ebullición. El azúcar directamente reductor se oxida y los iones Cu2++ se reducirán a Cu+ que precipitaran como Cu2O. El exceso de Cu2++ se determina yodometricamente. Ventajas:  Una ebullición de 10 minutos, la acción reductora de la glucosa y de la fructosa es por lo general igual en este espacio de tiempo permitiendo la elaboración de ambas.  No requiere una titulación de la solución de la titulación en ebullición como en Lane-Eynon. Desventajas:  La reacción de los azúcares y la disolución de Luff no es estequiométrica, siendo necesario un control exacto de las condiciones de trabajo (temperatura de ebullición para lograr una fiabilidad y repetibilidad)  En la reacción pueden interferir otras sustancias acompañadas que disminuirán la capacidad reductora de la disolución.  Debido a que el reactivo es menos alcalino que en Fehling, se trata entonces de una oxidante más débil requiriendo un mayor tiempo de ebullición

Método de Lane – Eynon: Este método es de mucho uso y se basa en la reacción de Fheling. Inicialmente la reacción de torna azul por la presencia del complejo de cobre, se empalidece al precipitar el óxido; el punto final de la titulación se indica por la incoloración de la solución. Para la titulación el indicador utilizado como punto final el azul de metileno que en su forma oxidada es de color azul y en su forma reducida incolora. Ventajas:  Determina exactamente el volumen de la solución problema requerido para reducir completamente el volumen conocido de solución alcalina de cobre Desventaja:  La reducción de cobre y oxidación de azúcares no es estequiometria.  Los azúcares difieren en su habilidad para reducir la solución cúprica.

Método de Brafoerd: Se utiliza para diferenciar entre mono y disacáridos reductores, contienen ion cúprico que se reduce a óxido cuproso más rápidamente con los monosacáridos que con los disacáridos. Ventajas: •

Permite diferenciar entre un monosacárido y un disacárido

Desventajas: •

Sus resultados son poco confiables, el test de Benedict.

6. BIBLIOGRAFÍA Cortes, J., Ibla, F., Calderón, L., y Herrera A. Quantification of reducing sugars from orange and banana Shell William Giovanni, revista de Tecnología Programa de Ingeniería Ambiental, Universidad El Bosque, Bogotá, Colombia, ¦ Journal Technology (en

línea),

12(2),

2008.

http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/FUNDAMENTOSYTECNICASDEANALISISDEALIMEN TOS_12286.pdf/. Acceso: 29 agosto (2016). Autores (institución), título del documento, tipo de medio (en línea, en CD), edición, lugar de publicación, editor o responsable, fecha de última actualización, fecha de consulta [requerido para documentos en línea, disponibilidad y acceso (requerido para documentos en línea). Gómez, D., Gutierrez, A., Villanueva J. 2010. Determinación de carbohidratos a través del método Miller, Ingeniería química, (en línea), Acceso: 29 agosto (2016), disponibilidad y acceso.

http://documents.mx/documents/determinacion-de-carbohidratos-por-medio-del-

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Bello D., Carrera E., Díaz Y. 2006. Determinación de azúcares reductores totales en jugos mezclados de caña de azúcar utilizando el método del ácido 3,5 dinitrosalicílico. ICIDCA. Sobre los Derivados de la Caña de Azúcar. ISSN: 0138-6204, [email protected]. Habana, Cuba. Fajardo C. Sarmiento S. 2007. Evaluación de melaza de caña como sustrato para la producción de Saccharomyces cerevisiae. Trabajo de grado para obtener el título de microbiólogo industrial. Universidad javeriana. Bogotá D.C. Herrera C 2011. Estudio comparativo de métodos para la determinación de sacarosa y azúcares reductores en miel virgen de caña utilizados en el ingenio pichichí S.A. Trabajo de grado como requisito para optar al título de tecnóloga en química en la modalidad de práctica empresarial. Universidad de Tecnológica de Pereira, Pereira....