Determinação laboratorial de enzimas LDH no soro PDF

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Material para estudo sobre o tema de Determinação Laboratorial de enzimas LDH no soro da professora Paula Bittencourt....

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Aula prática - Enzimologia Clínica e LDH Enzimas: proteínas com capacidade catalítica. Modelo chave-fechadura. Velocidade de reação: depende da concentração de enzima e substrato, temperatura e pH, ausência de inibidores, coenzimas. Enzimas são amplamente distribuídas no organismo, mas podem não ser específicas de alguns tecidos! Por exemplo, se temos uma enzima encontrada no fígado e no cérebro, ela não é específica, então se fizer a dosagem da enzima, não temos como saber se o aumento é oriundo do cérebro ou fígado. Como selecionar o teste? • Distribuição da enzima - onde ela é predominante • Localização intracelular da enzima - saber se a enzima é intra ou extracelular • Tempo de meia-vida - quanto tempo ela dura no organismo depois de sintetizada • Depuração - quanto tempo ela leva para ser depurada Dificilmente o clínico chega a uma conclusão só com quantificação de enzimas. Vantagens de dosar enzimas: • Especificidade - chave fechadura • Não necessita de purificação • Selecionar enzimas com maior especificidade Distribuição tecidual ampla: valor diagnóstico limitado. Pois o aumento da enzima não saberemos de qual tecido é. Distribuição tecidual restrita: mais específico. Maior importância clínica. Etapa pré-analítica: Atenção na escolha do anticoagulante, pois pode inibir a enzima, necessitando de uma nova coleta! Anticoagulante Oxalato, citrato e EDTA Oxalato Citrato e oxalato Heparina

Enzima inibida Amilase Transaminases Gama GT LDH

Amostra ideal para dosagem de enzimas é o soro, pois ele não terá nenhum aditivo, exceto quando se determinar enzimas plasmáticas específicas (como as da coagulação). Perda da atividade de enzimas: Nas enzimas não podemos aceitar hemólise (cor vermelha), se tiver e não puder solicitar uma nova amostra (idoso e crianças), devemos colocar em um tubo cônico e fazer a centrifugação, as hemácias tem tendência a se depositar nesse cone do fundo do tubo. Também não podemos utilizar soro lipêmico pois ele modifica a passagem de luz através da amostra. Enzimas são proteínas, as proteínas se degradam quando tem altas ou baixas temperaturas, portanto a amostra para quantificar enzimas não pode ser congelada. Também precisamos cuidar o tempo de análise.

Importância das características das enzimas na Bioquímica Clínica ll A determinação das enzimas em amostras de soro precisam ser em condições definidas e controladas, sendo um método sensível e específico. Velocidade de reação depende: • pH - reagentes precisam ser adequados • Tipo de tampão - dentro do prazo de validade • Temperatura - amostra e substrato em temperatura constante • Natureza do substrato • Concentração de ativadores • Tempo de reação - controlar variáveis Equipamentos utilizados: aparelho semi-automatizado com todas as condições controladas. São utilizados em laboratórios menores, pois em laboratórios maiores possuem aparelho completamente automatizado. Quantificação: é medida a atividade e não a quantidade. Dosadas por sua atividade, não por sua concentração. Quantidade de substrato que em uma reação enzimática particular é convertida em produto por unidade de tempo em condições determinadas. Atividade: quantidade de substrato que é convertida em produto (consumido) por unidade de tempo. Etapa analítica Metodologias: Analisam consumo de substrato: quantificam o substrato não consumido. Exemplo: amilase, eu tenho amido no meu tubo de ensaio e tenho a amilase no soro do paciente, o amido é transformado pela amilase em glicose, maltose, dextrinas... mas essa reação é feita em excesso de amido, vai sobrar amido (substrato que não foi hidrolisado), temos que adicionar outro reagente onde esse amido não hidrolisado será colorido com o iodo por exemplo, formando um complexo coloidal azul que será quantificado no espectofotômetro. Determinam a quantidade de produto formado por uma reação adequada: Produto corado: exemplo fosfatase alcalina (FAL) pelo método do p-nitrofenol. No tubo que tem só reagente de trabalho, temos o p-nitrofenilfosfato, no soro do paciente tem a FAL, acontece uma reação que libera fosfato inorgânico, e o pnitrofenol que sobra no meio é amarelo, quanto mais amarelo ficar, mais pnitrofenilfosfato foi transformado em p-nitrofenol. Produto não corado: (precisa ser transformado em produto corado), exemplo FAL pelo método de Roy, temos a substância timolftaleínamonofosfato no reagente de trabalho, e a FAL no soro do paciente, forma a timolftaleína + fosfato

inorgânico, como a timolftaleína é um marcador de pH, adicionamos um outro reagente, no caso um tampão alcalino que modifica o pH do meio dando uma coloração azul.

Analisam a variação da absorção da coenzima que participa da reação enzimática: Baseia-se no princípio de que das formas reduzidas das coenzimas (NADH e NADPH) absorvem energia na faixa UV do espectro (não é visível), enquanto que as formas oxidadas não apresentam essa absorção. Exemplo: LDH pelo método UV. Temos ácido láctico no reagente de trabalho, e LDH no soro do paciente, o ácido láctico que também está na presença do NAD+, o LDH transforma ácido láctico em ácido pirúvico e NAD+ em NADH e H+, teremos aumento da absorção através do NADH produzido. Também pode acontecer o contrário, podemos encontrar um reagente de trabalho com NADH e H+, que irá se transformar em NAD+, irá diminuir a absorção por causa do NADH consumido. Precisamos levar em consideração os erros da parte pré-analítica. Lactato Desidrogenase (LDH) É uma enzima inespecífica. Pode estar presente dentro de vários tecidos como fígado, eritrócitos, coração, músculos... Ela é interna e intracelular. Apresenta várias isoformas, dentre elas: LDH-1: LDH-2: LDH-3: LDH-4: LDH-5:

coração, hemácias, rins coração, SER pulmão e outros tecidos placenta e pâncreas fígado e músculo esquelético

Quando eu quantifico LDH de maneira enzimática, eu estou quantificando todas as suas isoformas. Os níveis teciduais são cerca de 500x maiores que os normalmente encontrados no soro. Uma lesão tecidual causa vazamento da enzima no soro, aí será possível a quantificação.

Metodologia: Piruvato-Lactato Princípio: a atividade da LDH é determinada de acordo com a seguinte reação: Piruvato + NADH + H LDH  Lactato + NAD A LDH catalisa a conversão do piruvato a lactato na presença de NADH. O decréscimo da absorbância em 340 nm (UV, não consigo ver a olho nú) devido a oxidação do NADH é proporcional à atividade da LDH na amostra.

LDH mede que tipo de produto? É verificado através da luz UV e mede geralmente a redução ou oxidação de uma coenzima, sendo sempre proporcional a atividade da enzima na amostra. Amostras: • Soro ou plasma (não usar heparina, pois ela inibe a enzima LDH) • Também líquor (centrifugar antes do teste) • Plasma com oxalato não deve ser usado. Separar o soro ou plasma das hemácias em seguida após a obtenção da amostra. Não usar soro ou plasma hemolisado, pois as hemácias contém mais atividade de LDH do que o soro.

Reagentes Reagente 1: Armazenar entre 2-8°C Contém NADH 360umol/L e azida sódica 0,095% Reagente 2: Armazenar entre 2-8°C Contém tampão 250mmol/L, pH 7,5; piruvato de sódio em 6mmol/L e azida sódica 0,095%. Preparo do reagente de trabalho: O conjunto de um frasco do Reagente 1 e um frasco do Reagente 2 permite preparar o Reagente de Trabalho. Tampão e coenzima é muito instável, por isso devemos preparar no mesmo dia. Transferir o conteúdo de um frasco do Reagente 2 para um frasco do Reagente 1 e homogeinizar por inversão. Anotar a data de expiração. Estável 1 dia entre 1525°C e 10 dias entre 2-8°C quando não houver contaminação química ou microbiana. Para preservar seu desempenho o reagente deve permanecer fora da geladeira somente o tempo necessário para se obter o volume a ser utilizado. Evitar exposição à luz solar direta. Identificar o frasco do Reagente de Trabalho para evitar confusão com outros frascos do Reagente 1. Reação cinética com leitura de ponto final: início da reação enzimática e estabelecimento da reação. Procedimento 1. Selecionar um tubo, identificar. 2. Adicionar 20uL de amostra e 1,0mL do reagente de trabalho, misturar e transferir para cubeta termostatizada IMEDIATAMENTE para realização das leituras na cubeta de fluxo que irá sugar a amostra e aconteça a incubação lá dentro no banho maria. 3. Fazer a leitura da absorbância inicial (A1) disparando simultaneamente o cronômetro. Repetir a leitura após 2 minutos (A2). No tempo zero, onde faz a primeira leitura da A1, a curva começando a subir acontece dentro do aparelho com as condições para reação enzimática controlada (temperatura, pH...) Após 2 minutos o aparelho irá fazer a segunda leitura que é o momento em que o complexo substrato-produto consegue alcançar o platô.

Para avaliar a linearidade da reação, verificar se as absorbâncias medidas em intervalos de 1 minuto são compatíveis. Calcular o deltaA/minuto subtraindo A2 de A1 e dividindo por 2. Absorbância inicial (A1) igual ou menor que 0,8 é um indicativo de que a amostra tem atividade elevada da LDH. Neste caso, repetir a medição da amostra diluída. Os fotômetros semiautomáticos podem fornecer a mensagem "substrato esgotado".

Cálculos Quando é utilizado aparelho semi-automatizado o cálculo sai pronto. É uma prática habitual calcular os resultados de atividade enzimática utilizando um fator obtido em condições ótimas de reação que incluem: • Comprimento de onda: 340nm +- 0,2 nm • Cubeta termostatizada a 37 +- 0,2°C com 1,0cm de espessura de solução. • Banda de passagem...