Visualización Histoquímica de enzimas PDF

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Una enzima es una proteína específica, que para su identificación necesitan un sustrato muy similar o realizar una serie de reacciones para obtener un compuesto coloreado....

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Visualización Histoquímica de enzimas Una enzima es una proteína específica, que para su identificación necesitan un sustrato muy similar o realizar una serie de reacciones para obtener un compuesto coloreado. Son individualidades químicas definidas, las cuales identificamos debido a su gran cantidad de grupos funcionales y su actividad enzimática. Son altamente específicas para un sustrato y la reacción que catalizan. Es importante la conservación del tejido, ya que las enzimas se encuentran en pequeñas cantidades y difunden rápidamente, ya que se pierden en medios acuosos, calor, fijación con alcoholes o formalina, etc. Se debe realizar una congelación, posterior almacenamiento y corte en criostato. El traslado es primordial para conservar las enzimas, en el caso del Van Buren, se envía una biopsia en una gasa (o papel filtro) humedecida en suero fisiológico, sin sobrenadante cerrada herméticamente para evitar oxidación y desecamiento. Otras maneras de transporte son tubos de ensayo, envases de vidrio o plástico, y para realizar un traslado de distancias (que no sean más de 2 horas de viaje) se ponen en un “cooler” o termo con hielo. Una vez recibida la muestra se conserva directamente en nitrógeno líquido a -160°C en un contenedor de plástico, o se puede realizar un previo paso por isopentano, ya que tiene un punto de congelación mucho más bajo que el agua. Otro método es la congelación con CO2, y posterior a la congelación, independiente del método empleado, la muestra se puede almacenar en un refrigerador a -70°C, y por eso, es recomendable utilizar contenedor de plástico por el cambio brusco de temperatura al momento de recibir, congelar y almacenar la muestra. Existen enzimas que permiten una breve fijación, pero eso estará determinado por los protocolos. Las enzimas que nosotros usualmente trabajamos son para identificar displasias intestinales, no permiten fijación. La mayoría de los protocolos, posterior a realizar la identificación de la actividad enzimática, proceden a una breve fijación en acetona, alcohol o formol buffer (10 minutos en clopin). Otras enzimas, como las sulfatasas, permiten fijación e inclusión en parafina de no muy alta graduación. Existe un gel llamado embeding u OCT, el cual es transparente, como una glicerina. Este sirve como soporte para poder realizar el corte. De no haber, se puede utilizar agua destilada haciendo una "montañita", pero estos soportes no difunden a la muestra como la parafina. Para la incubación se debe utilizar material de vidrio (o plástico) lavado químicamente, se incuba a 37°C, se realizan lavados en suero fisiológico, pH acorde a la enzima con la que se trabaja, se incuba siempre varias placas. La incubación se realiza en el sustrato de la enzima, el cual puede ser hidrolizado, oxidado o reducido, en un medio tamponado isotónico. En caso de que la enzima lo requiera, se debe emplear un activador especifico, la temperatura debe estar bien regulada, y se debe activar el sustrato para obtener un compuesto coloreado.

No se pueden llevar controles externos paralelos, por la dificultad del corte. En caso de tener un control, éste debe ser inactivado por la enzima mediante calor, también se puede suprimir algún compuesto fundamental, o se agrega a la incubación un inhibidor especifico.

Para una localización precisa de la actividad enzimática necesitamos que exista una gran actividad enzimática, el cromógenos difunda poco, el cromógeno sea insoluble, la afinidad del cromógeno por la estructura celular que contiene la enzima sea alta. Y en cuanto a la solubilidad de la enzima, encontraremos la siguiente clasificación:  

lioenzimas: Enzimas solubles en medio acuoso o mezclas hidroalcohólicas. Desmoenzimas: Enzimas ligadas a elementos insolubles el citoplasma.

Las enzimas poseen un nombre específico para cada una, por ejemplo, a la acetilcolinesterasa se le asigna el nombre EC 3.1.1.7, lo cual significa: 3 = hidrolasa 3.1 = actúa sobre las uniones ester 3.1.1 = de los ácidos carboxílicos 3.1.1.7 = es la séptima enzima del grupo hidroxicarboxil hidrolasas Clasificación de las enzimas según su actividad 1. Oxido Reductasas: Las enzimas catalizadoras de reacciones de óxido reducción son reveladas por medio de sustratos que contienen sales de tetrazolio que se reducen dando compuestos altamente coloreados, formazanes. 2. Transferasas 3. Liasas 4. Hidrolíticas: Son difíciles de dar productos coloreados, necesitan en el medio de incubación un compuesto que aumente su precipitación a una forma insoluble. Dentro de esta categoría tenemos fosfatasas, esterasas, carbonidasa, fosforilasa. En cuanto a la fosfatasa tenemos alcalina, ácida y triosfatasa (ATP). Las fosfatasas alcalinas poseen una actividad óptima a pH elevado (8,3 – 9,4), mientras que las fosfatasas ácidas tienen una actividad óptima a pH bajo (4,7 – 5,5) La criodesecación es la que mejor permite la conservación de las enzimas. Pero la única que permite una parafina de baja graduación es la fosfatasa alcalina. Otra enzima hidrolítica es la colinesterasa, la cual hidroliza ésteres de colina, poseen rápida autolisis, rápida difusión, pero no permite inclusión en parafina.

Para poder visualizar las enzimas hidrolíticas, se debe considerar que se liberara un compuesto, que va a ser insolubilizado, y posterior a esta reacción se podrá observar el compuesto estudiado coloreado. Un ejemplo es la liberación de un compuesto naftólico soluble, el cual será insolubilizado al ser captado por una sal de diazonio (la cual no es coloreada), y dicha reacción provocará un colorante azoico. La fosfatasa alcalina (EC 3.1.3.1), se puede reconocer con método de Gomori, permite una fijación suave en formol al 4°C antes de ser congelada, se trabaja con un pH óptimo de 8,6 y para poder visualizarlo, el buffer utilizado no debe contener fosfato (descartado PBS). Para visualizar la fosfatasa alcalina se puede hacer mediante dos métodos, ambos con sustrato de B-glicerofosfato de sodio. El primer método constara de captación del ion fosfato liberado por nitrato de plomo, formando fosfato de plomo, el cual es incoloro, y que, al momento de reaccionar con sulfuro de amonio, formará sulfuro de plomo, el cual da un color parduzco. El segundo método es similar, pero el ion es capturado por calcio, se forma fosfato de calcio, posterior a eso se agrega nitrato de cobalto formando fosfato de cobalto y, éste último, al momento de agregar sulfuro de amonio formará sulfuro de cobalto, el cual es de color negro. En el caso de la fosfatasa ácida, son enzimas lisosomales, la monoesterasa hidroliza los monoésteres del ácido fosfórico, se usa un pH de 4.5, es abundante en nuestro organismo, permite una fijación corta en formol a 4°C, sirve para Gomori, pero si se fija en formol, la formalina inhibe la función de la fosfatasa en riñón e hígado. Usa el mismo principio que la otra fosfatasa, solo que a diferente pH. Para visualizarla, se usa de sustrato Naftol-AS-BI fosfato, se obtienen ésteres de naftol que formaran B naftol y fosfatos, se agrega una sal de diazonio (la cual es incolora, pero dependerá del tipo de sal la coloración final), y se obtiene un colorante azoico. Las sales de diazonio son compuestos orgánicos solubles, incoloras en estado oxidado y altamente coloreados en estado reducido. Existe fast red B, fast blue b, y fast black b. Otra enzima hidrolítica es la ATPasa, ésta es una enzima específica, catalizan la hidrólisis de ATP transformándola en adenosin difosfato. Depende del pH empleado en el buffer, se utiliza para tejido muscular y es superior (hasta ahora) que las técnicas inclusive de IHQ. El pH optimo es cercano a 9, se incuba en un medio con ATP (sustrato) y se obtiene un producto coloreado por reacción con cobre y sulfuro de amonio En la imagen se observan fibras musculares, en las cuales las más claras corresponde a fibras tipo 1, y las más oscuras son tipo 2. Se usó un pH alto para poder realizar run conteo de fibras tipo 2 en el tejido muscular de un niño.

Oxido reductasa 

 

Oxidasas: catalizan la transferencia de hidrogeno sobre el oxígeno molecular. Catalizan la oxidación de coenzimas, ácidos grasos, aminoácidos, citocromos, etc. Poseen fierro que pasa del estado oxidado al reducido, y se encuentran en las mitocondrias. Peroxidasas: catalizan la transferencia de hidrogeno sobre los peróxidos Deshidrogenasas: catalizan la transferencia de hidrogeno del oxígeno u otro aceptador. Enzimas detectadas por un aceptor artificial de electrones. Se reconoce por una sal de tetrazolio, que acepta electrones reduciéndose a formazan (compuesto altamente coloreado). Esta reacción en la misma incubación se necesita un aceptor intermediario de electrones, coenzima o acelerador. La deshidrogenasa no resiste fijación.

Las sales de tetrazolio son compradas, y según el color que den tendrán un nombre diferente. Cloruro de neotetrazolio (rosado), azul de tetrazolio (celeste), yodo nitrotetrazolio (café), nitroBlue de T (azul oscuro), tetranitroblue de tetrazolio (azul negruzco). Son compuestos heterocíclicos (muchos anillos), estables, se recomienda que posean diformazanes, son puras, no se reducen fácilmente con la luz, insolubles en lípidos u otras proteínas.

H-E

ATPasa a distintos pH...