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Informe Enzimas de restricción...

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Enzimas de Restricción.

María José Berrio Silgado. Keidis Bolaño Quintero. Bryan Girón Castro. Esteban Royet Jiménez.

Ramón Lozada Devia.

Laboratorio de Genética. Licenciatura en Biología y Química Facultad de Educación Universidad del Atlántico Puerto Colombia 2018

Contenido Introducción............................................................................................................................3 Objetivos.................................................................................................................................4 Objetivo General.................................................................................................................4 Objetivos específicos..........................................................................................................4 Marco Teórico.........................................................................................................................5 Existen 3 tipos de enzimas de restricción:..........................................................................5 Tipo I y Tipo III:.............................................................................................................5 Tipo II..............................................................................................................................5 Aplicaciones de las enzimas de restricción:....................................................................6 Proceso de la enzima de restricción................................................................................8 La ADN ligasa.....................................................................................................................9 Factores que afectan la actividad de la enzima de restricción..........................................12 Conclusión............................................................................................................................13

Introducción. En la clonación de ADN, los investigadores hacen muchas copias de un fragmento de ADN específico, como un gen. En muchos casos, la clonación consiste en introducir el gen en un fragmento de ADN circular llamado plásmido que puede copiarse en bacterias. ¿Cómo se pueden unir fragmentos de ADN de diferentes Fuentes para hacer una sola molécula de ADN? Un método común utiliza enzimas de restricción y ADN ligasa. Una enzima de restricción es una enzima que corta ADN y que reconoce sitios específicos en él. Muchas enzimas de restricción hacen cortes escalonados en o cerca de su sitio de reconocimiento y producen extremos sobresalientes de cadena sencilla. Si dos moléculas de ADN tienen extremos complementarios, la enzima ADN ligasa puede unirlos. La ADN ligasa sella el espacio entre las moléculas para formar un solo fragmento de ADN. Las enzimas de restricción y la ADN ligasa se suelen usar para insertar genes y otros fragmentos de ADN en plásmidos durante la clonación de ADN. Las enzimas de restricción se denominan también nucleasas de restricción, endonucleasas de restricción y en ocasiones restrictasas. Pertenecen a este grupo una gran diversidad de endodesoxirribonluceasas, descubiertas como enzimas propias de distintas bacterias. Se dispone hoy comercialmente de un gran número de ellas con elevada especificidad, estabilidad y pureza.

Objetivos Objetivo General  Explicar cómo trabaja la enzima de restricción en el proceso de replicación del ADN.

Objetivos específicos  Identificar los tipos de Enzimas de Restricción.  Describir el proceso de corte y empalme del ADN que se realiza con las enzimas y la ADN ligasa.  Enunciar los factores que afectan la actividad enzimática de la Enzima de restricción.

Marco Teórico Las enzimas de restricción, también conocidas como endonucleasas, son enzimas que cortan los enlaces fosfodiéster del material genético a partir de una secuencia que reconocen. Las mismas permiten cortar DNA de hebra doble, donde reconocen secuencias palindrómica (secuencias que se leen igual en ambas direcciones). Son extraídas de organismos procarióticos (bacterias), donde actúan como un mecanismo de defensa, para degradar material genético extraño que entre en la célula. Las bacterias tienen la capacidad de metilar su DNA, lo cual sirve para distinguir entre el DNA extraño y el DNA propio. Las enzimas de restricción no pueden cortar DNA metilado, de este modo solo afectan el DNA extranjero y no el DNA bacterial.

Existen 3 tipos de enzimas de restricción: Tipo I y Tipo III: Las enzimas de restricción de Tipo I y III reconocen una secuencia específica pero cortan a una distancia variable del sitio de reconocimiento (sitio de restricción). a. Tienen actividad de restricción (cortan) y modificación (metilan). b. Cortan a cierta distancia de la secuencia de reconocimiento, las Tipo I cortan lejos de la secuencia de reconocimiento, ya sea río arriba o río abajo. Las Tipo III cortan de 5-8 bases antes o después de la secuencia que reconocen. c. Necesitan ATP para moverse a través de la molécula de DNA, desde el lugar de reconocimiento hasta el sitio del corte. Tipo II Las enzimas de Tipo II pues, al cortar en un punto muy definido dentro de su secuencia diana, son utilizadas como herramientas en ingeniería genética.

Se descubrieron en los años 60 y su uso en biología molecular empezó en los 70 permitiendo el desarrollo de las tecnologías de ADN recombinante. Las enzimas de restricción tienen actividad endonucleasa y cortan enlaces fosfodiéster en las dos cadenas del ADN. Reconocen ciertas secuencias en el ADN. Las enzimas de restricción de Tipo II reconocen una secuencia específica conocida como secuencia diana y siempre cortan entre los mismos nucleótidos. De ahí que generen siempre los mismos fragmentos de restricción. La secuencia diana es de tamaño variable, la mayoría de 4 y 6 nucleótidos, y con frecuencia es parcialmente palindrómica. Algunas enzimas de restricción cortan generando extremos llamados romos mientras que otras cortan generando extremos llamados cohesivos. Entonces: a. Sólo tienen actividad de restricción. b. Cortan de manera consistente y predecible dentro de la secuencia que reconocen. c. Sólo requieren Mg++ como cofactor. d. No necesitan ATP. Aplicaciones de las enzimas de restricción: La importancia de las enzimas de restricción radica en su gran especificidad para reconocer una secuencia corta de DNA bicatenario e hidrolizar un enlace fosfodiéster en cada hebra, siempre en la misma posición. Cada enzima se caracteriza, pues, por su sitio o secuencia de reconocimiento o de restricción, o secuencia diana. Los fragmentos de DNA resultantes son útiles para iniciar la clonación celular o acelular, para el análisis del DNA, para elaborar mapas físicos de restricción o para la detección de polimorfismos. a. Hacer mapa de restricción de un plásmido o bacteriófago. b. Fragmentar DNA genómico para separación de electroforesis y “Southern Blot”. c. Generación de fragmentos para ser usados como sondas marcadas en “Southern” y “Northern” blotting. d. Generación de fragmentos para ser subclonados en los vectores apropiados, creación de DNA recombinante.

Las endonucleasas se nombran a partir de las bacterias de las que son extraídas, su nombre está dado según el género y la especie de la bacteria de donde se aisló por primera vez esta enzima. La primera letra representa el género de la bacteria, las próximas dos indican la especie, una cuarta letra indica la cepa, y un número al final indica la cantidad de enzimas que se han aislado de esa cepa. Un ejemplo la Eco RI (tabla 1). Eco RI E = género Escherichia. co = especie coli. R = cepa RV 13. I = primera endonucleasa aislada de esta cepa. Tabla 1. Eco RI

En la imagen 1 se denotarán las enzimas extraídas de un determinado organismo.

Imagen 1. Organismo de donde se extrae la enzima de restricción.

Proceso de la enzima de restricción. Las enzimas de restricción al cortar el DNA pueden producir 2 tipos de cortes: 1. Cohesivos o pegajosos: GAATTC CTTAAG EcoRI

GGATCC CCTAGG BamHI

AAGCTT AACGAA HindIII

2. Abruptos: AATATT TTATAA SspI

CCCGGG GGGCCC SmaI

Como un ejemplo de cómo una enzima de restricción reconoce y corta en una secuencia de ADN, se analizará la EcoRI (Imagen 2), una enzima de restricción de uso común en el laboratorio. EcoRI corta en el siguiente sitio:

Imagen 2. Sitio Eco RI

Cuando EcoRI reconoce y corta este sitio, siempre lo hace en un patrón muy específico que produce extremos sobresalientes de ADN de cadena sencilla (Imagen 3):

Imagen 3. Reconocimiento y corte que produce 2 extremos de ADN.

Si otro fragmento de ADN tiene secuencias sobresalientes complementarias (porque también se cortó con EcoRI, por ejemplo), los extremos pueden unirse por complementariedad de bases. Por esta razón se dice que las enzimas que dejan extremos de cadena sencilla producen extremos cohesivos. Los extremos cohesivos son útiles en la

clonación porque mantienen dos fragmentos de ADN juntos para que la ADN ligasa los pueda unir. No todas las enzimas de restricción producen extremos cohesivos. Algunas producen "extremos romos", cortes a la mitad de la secuencia blanco que no dejan extremos de cadena sencilla. La enzima de restricción SmaI (Imagen 4) es un ejemplo de enzima que corta así:

Imagen 4. Extremos rotos de la SmaI.

La ADN ligasa puede unir fragmentos romos entre sí. Sin embargo, es más difícil ligar fragmentos romos (la reacción de ligación es menos eficiente y es más probable que falle) porque no hay secuencias sobresalientes de cadena sencilla que sostengan a las moléculas de ADN en su posición.

La ADN ligasa En la replicación del ADN, se encuentra la ADN ligasa. En la replicación del ADN, el trabajo de la ADN ligasa es unir fragmentos de ADN recién sintetizados para formar una cadena continua. Las ligasas utilizadas en la clonación de ADN hacen básicamente lo mismo. Si dos fragmentos de ADN tienen extremos complementarios, la ADN ligasa puede unirlos para formar una molécula sin interrupciones (Imagen 5).

Imagen 5. Ligasas de ADN.

Mediante el uso de ATP como fuente de energía, la ligasa cataliza una reacción en la que el grupo fosfato del extremo 5' de una cadena de ADN se une al grupo hidroxilo del extremo 3' de la otra cadena. Esta reacción produce un esqueleto de azúcar-fosfato intacto.

¿Cómo la digestión con enzimas de restricción y la ligación pueden utilizarse para insertar un gen en un plásmido? Supongamos que tenemos un gen blanco, flanqueado por los sitios que reconoce EcoRI (Imagen 6), y un plásmido que contiene un solo sitio de EcoRI:

Imagen 6. Sitios de reconocimiento EcoRI.

El objetivo es utilizar la enzima EcoRI para insertar el gen en el plásmido. Primero, se digiere por separado con EcoRI el fragmento del gen y el plásmido. Este paso produce fragmentos con extremos cohesivos (Imagen 7):

Imagen 7. Creación de extremos cohesivos producidos por la EcoRI.

A continuación, se toma el fragmento del gen y el plásmido linearizado (abierto) y se combina con ADN ligasa. Los extremos cohesivos de ambos fragmentos se unen por apareamiento complementario de bases (Imagen 8):

Imagen 8. Adición del gen al plásmido.

Una vez que los une la ligasa, los fragmentos se convierten en un solo fragmento de ADN sin interrupciones. El gen blanco ya se ha insertado en el plásmido y se tiene un plásmido recombinante (Imagen 9).

Imagen 9. Gen insertado en el plásmido.

Factores que afectan la actividad de la enzima de restricción. Existen varios factores que son críticos al trabajar con enzimas de restricción y que pueden afectar la actividad de las mismas: 1. Pureza del DNA – la reacción de enzimas es muy dependiente de la pureza, contaminantes

como

proteínas,

fenol,

cloroformo,

etanol,

EDTA,

SDS,

altas

concentraciones de sal, etc. inhiben la endonucleasa. 2. Temperatura y pH – las enzimas son muy sensitivas a temperatura y pH en lo que respecta a su estabilidad y actividad. 3. DNAsas – Las DNAsas degradan el DNA en presencia de Mg++ . 4. Contaminantes con carga (-). 5. DNA contaminado con otro DNA. 6. Grados de metilación – algunas endonucleasas son inhibidas por metilación. 7. Tipo de molécula de DNA – si el DNA no tiene la secuencia que es reconocida por la enzima accesible, esta no puede cortar el material genético (ej. si el DNA está superenrrollado el lugar de restricción no va a estar accesible para la enzima). 8. Buffer adecuado – este provee el ambiente que necesita la enzima para trabajar en condiciones óptimas. Importante: Una unidad de enzima se define como la cantidad de enzima que se necesita para cortar 1μg de DNA en 1 hora. El buffer siempre debe añadirse como un 10% de la reacción total de digestión.

Conclusión En la reacción de ligación podrían ocurrir otros resultados. Por ejemplo, el plásmido cortado podría recircularizarse (cerrarse en su estado original) sin incorporar el gen. Asimismo, el gen podría entrar al plásmido, pero en dirección contraria (puesto que sus dos extremos cohesivos de EcoRI son idénticos). La digestión con enzimas de restricción y la ligación como esta se realiza con muchas copias de ADN del plásmido y del gen. De hecho, en una sola ligación se utilizan miles de millones de moléculas de ADN Todas estas moléculas están chocando entre sí y con la ADN ligasa al azar y de diferentes maneras. Por lo tanto, si es posible formar varios productos, todos se producirán con cierta frecuencia, incluyendo los que no queremos.

Bibliografía Bergmann, D. (2011). Biotecnología. [Material para clase] En BIO41: 2011 Clases de biología molecular sobre ADN, ARN y biotecnología. Metzenberg, S. (2002). Lecture 5: Restriction endonucleases (Clase 5: Endonucleasas de restricción). En Recombinant DNA techniques (Técnicas de ADN recombinante). Reece, J. B., Urry, L. A., Cain, M. L., Wasserman, S. A., Minorsky, P. V. y Jackson, R. B. (2011). DNA tools and biotechnology (El ADN como herramienta y la biotecnología). En Campbell biology (10° ed., págs. 408-435). San Francisco, CA: Pearson....