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C. FOULON - MCU...

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2017-2018

Electrophorèse capillaire Electrophorèse capillaire

– UE VIII:Chimie analytique – Semaine : n°9 (du 30/10/17 au 3/11/17) Date : 03/11/2017

Heure : de 8h00 à 9h00

Binôme : n°104

Professeur : Pr. Foulon Correcteur : n°105

Remarques du professeur (Diapos disponibles, Exercices sur le campus, Conseils, parties importantes à retenir, etc.) Mettez les informations Sous forme De liste

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PLAN DU COURS PLAN DU COURS :

I) Grandeurs fondamentales A) Grandeur de rétention B) La résolution

II) Application de l'électrophorèse capillaire : analyse qualitative et quantitative A) Analyse qualitative B) Analyse quantitative 1)

Etalonnage

2)

Mode de détection

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I)

Electrophorèse capillaire

Grandeurs fondamentales A) La grandeur de rétention

Le temps de migration est le temps écoulé entre l’injection du soluté et l’apparition du sommet du pic (T0 n’est pas défini). L’efficacité ou nombre de plateaux théoriques N est propre à chaque soluté et dépend de la longueur de la bande d’injection et des phénomènes d’absorption.

La hauteur équivalente à un plateau théorique (H) :

H = L/N

B) La résolution La résolution va être définie de la même manière qu'en chromatographie sauf qu'au lieu de prendre des temps de rétention nous allons prendre des temps de migration. Elle va être systématiquement calculée soit à partir de la largeur des pics à la base soit à partir de la largeur des pics à mi hauteur. On va considérer que les 2 composés sont suffisamment séparés pour pouvoir faire une analyse quantitative. C'est-àdire d'être capable de récupérer l'air sous le pic correspond à un seul composé si la résolution ≥ 1,5. Donc dans la zone de proximité des 2 pics nous allons avoir un recouvrement des pics qui sera négligeable (cela concerne notamment les courbes de Gauss < 0,3%)

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Electrophorèse capillaire

Question 1 : Quelle est l'affirmation inexacte ? En électrophorèse capillaire, le flux électro-osmotique est : A: Concerne toutes les espèces en solution B: Dépend de la tension appliquée aux bornes du capillaire C: Est négligeable à pH 3 D: Dépend de la composition de l’électrolyte de séparation Réponse : B Le flux électro-osmotique est un écoulement de l'électrolyte de séparation qui remplit le capillaire sous l'effet du champ électrique imposé aux bornes du capillaire quelques soit les phases dans lesquelles se trouve la molécule qu’elle soit anionique, cationique ou neutre. C'est un courant qui va entrainer les espèces vers le détecteur. Le flux électro-osmotique est uniquement lié à l'état d'ionisation du capillaire qui est indépendant de la tension que nous allons appliquer. Donc c'est lié au pH de la solution d'électrolyte de séparation et cela dépendant notamment de la composition de l'électrolyte de séparation.

Le pH de la solution d'électrolyte de séparation joue sur l'état d'ionisation du capillaire.

C'est un phénomène qui est négligeable à pH 3 donc le flux n'entrainera pas les espèces vers le détecteur.

Au point d'infection de ces courbes on se retrouve au pKa de la silice (pKa= 6) et nous avons 50% du capillaire qui va être ionisé. On commence à avoir un flux dès pH 4 et il devient maximale au-delà de pH 8.

Question 2 : Quelle est l'affirmation inexacte ? En électrophorèse capillaire, si on utilise un capillaire de silice vierge, le flux électro-osmotique : A: Entraine toutes les espèces vers la cathode B: Dépend du pH de l'électrolyte de séparation C: Est a l'origine de la séparation des composés D: Peut être évalué à partir du temps de migration d'un composé neutre Réponse : C 3/14

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Electrophorèse capillaire

Le flux électro-osmotique est lié à la ionisation du capillaire. Donc nous allons avoir un capillaire qui va devenir anionique sous l'effet de la mise en contact avec un électrolyte de pH > 4. Nous allons avoir un excès de cation sur l'électrolyte, certains de ces cations vont se coller sur la paroi du capillaire. Quand nous allons imposer la différence de potentielle aux bornes du capillaire, ces cations en excès sont solvatés et se déplacent en bloc vers la cathode ce qui entraine l'écoulement de la solution vers la cathode. Le flux électro-osmotique dépend du pH de l'électrolyte de séparation. C'est un phénomène qui est non sélectif donc il n'est pas à l'origine de la séparation des composés. Le phénomène qui est à l'origine de la séparation des composés est le flux électrophorétique (c'est la capacité des molécules qui sont chargées de se déplacer sous l'effet du champ électrique) Quand nous avons un cation il va être attiré par la cathode. Le flux électrophorétique va dépendre de la mobilité électrophorétique, de la charge et de la taille des composés. On évalue toujours le flux électro-osmotique à partir de l'injection d'un composé neutre. Une molécule neutre ne possède pas de mobilité électrophorétique donc elle va nous permettre d’évaluer ce flux électro-osmotique. Question 3 : Quelle est l'affirmation exacte ? En électrophorèse capillaire : A: On ne peut séparer que des composés ionisés B: Le flux électrophorétique est à l'origine de la séparation des composés C: Un composé de petite taille migre plus vite qu'un composé de taille élevée D: L'injections se fait toujours à l'anode Réponse : B On peut séparer des composés ionisés mais également des molécules neutres. Le flux électrophorétique est à l'origine de la séparation. Un composé de petite taille migre plus vite qu'un composé de taille élevée. Cela n'est pas toujours vrai car la migration dépend de la charge de la molécule. Par exemple, si nous avons un cation qui va être entrainé par une mobilité électrophorétique et qui va dans le même sens que la mobilité électro-osmotique. Les 2 phénomènes vont s'additionner.

Formule mobilité électrophorétique :

Si la taille de l'ion augmente nous allons avoir une mobilité électrophorétique plus petite et donc la mobilité apparente (mobilité apparente = mobilité électrophorétique + mobilité électro-osmotique) sera également plus petite.

On peut faire l'injection de la solution au niveau de la cathode mais aussi au niveau de l'anode. 4/14

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II) Application de l'électrophorèse capillaire : analyse qualitative et quantitative A)

Analyse qualitative

Quand nous voulons faire de l'analyse qualitative, nous voulons identifier des composés dans un mélange. Pour cela on va procéder par comparaison avec des échantillons témoins. On va préparer des solutions témoins qui ne contiennent qu'une substance (= témoin pure) que l'on va analyser dans des conditions identiques à celles utilisées pour l'analyse du mélange qui nous intéresse.

Une fois que nous avons enregistré l'électropherogramme pour notre mélange (nous allons obtenir plusieurs pics) et injecté les composés que l'on pense être présent, il suffira de comparer ces électrophérogrammes. Pour identifier les composés présents dans ce mélange, on pourra comparer soit les temps de migration soit évaluer dans chaque cas la mobilité apparente permettant ainsi de comparer la mobilité apparente. Mais nous ne sommes pas à l'abris d'avoir dans notre mélange 2 composés de taille voisine, de charge voisine et donc qui se déplaceraient à peu près à la même vitesse, avec des temps de migration à peu près équivalent. C'est pourquoi, on devra faire appelle (comme en chromatographie) à des détecteurs qui nous permettront d'avoir des données spectrométriques notamment un détecteur UV-VSIBLE utilisant des barrettes de diodes. Avec ce genre de détecteur nous allons être capable de mesurer en continue le spectre des espèces additionnés à l'électrolyte de séparation et qui passent dans la fenêtre de détection. Mais un spectre UV ce n'est pas très spécifique donc c'est pour cela que nous développons des systèmes avec un couplage à la spectroscopie de masse. Cela va permettre d'avoir une égalité des temps de migration, d'accéder à la masse exacte de nos composés et d'accéder également à des fragments qui se sont produit lors de la ionisation des composés dans le spectromètre de masse. 5/14

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Ces fragments vont être caractéristiques d'une molécule car en fonction de la structure fine de la molécule elle ne va pas se couper au même endroit même si elle a la même masse molaire. Donc ici, nous serons capable de dire avec certitude la nature de l'espèce que nous voulons analyser.

B) Analyse quantitative

Quand nous voulons faire de l'analyse quantitative, donc pour doser une ou plusieurs espèces dans un mélange on fait un étalonnage. Nous allons comparer la solution inconnue à des solutions étalons que nous avons préparé et dont nous connaissons la concentration.

1)

Etalonnage

En électrophorèse capillaire, nous utilisons une seule méthode d'étalonnage, c'est l'étalonnage interne.

Pour l'étalonnage externe nous préparons une série de solution témoin qui contient la même substance que le contenu à analyser. Cette technique d’étalonnage est intéressante quand nous maîtrisons bien le processus d'analyse et quand nous faisons très peu d'erreur (par exemple par d'erreur au niveau du volume à injecter).

En électrophorèse capillaire, nous avons des petits flacons qui contiennent l'échantillon à séparer. Nous allons souvent appliquer une pression sur la surface du liquide pour faire monter un petit peu de l'échantillon dans le capillaire. -9

Le volume que nous injectons est de l'ordre de 1nanolitre (= 10 litres) donc nous appliquons une pression très faible pendant un temps très court (moins d'une seconde). Donc même si les appareils sont très performants nous avons du mal à répéter exactement la même quantité à injecter. Si nous voulons avoir de bon résultats, nous ne pouvons pas faire un dosage par un étalonnage externe. Pour l'étalonnage interne, nous allons préparer une série d'échantillon à doser qui contient la substance d’intérêt à doser en concentration croissante et dans laquelle nous avons ajouter dans chacune d'elle une substance supplémentaire (= étalon interne) qui va permette de corriger les erreurs liées au volume d'injection que nous ne maîtrisons pas bien. 6/14

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Cet étalon interne, nous allons aussi le rajouter dans l'échantillon inconnu. Donc nous allons faire une préparation de cet échantillon inconnue. L'exploitation des résultats va varier selon le type de détecteur ou selon le mode de détection que nous allons utiliser.

2)

Mode de détection

Ce qui est le plus utilisé dans les laboratoires, c'est le détecteur UV-VISIBLE à barrette de diode ou des détecteurs de fluorescence. Quand nous utilisons ce type de détecteur, la détection se fait sur le capillaire. Le capillaire est un petit tube recouvert d'un revêtement jaune. Nous avons brulé avec un briquet ce revêtement sur quelques millimètres pour ménager une fenêtre transparente sur laquelle on va faire venir une fibre optique pour mesurer l'absorbance. Ensuite on récupère un pic d'électrophorèse qui dépend de l'absorbance mesurée.

Quand la détection est on line, au lieu de prendre classiquement l'aire du pic nous allons à la place prendre en compte l'aire corrigée. L'aire corrigée, c'est le rapport de l'aire du pic sur le temps de migration.

Quand on fait une détection sur un système quelconque, l'appareil ne fait pas des mesures en continue mais il va faire par exemple une mesure toutes les 10ème de secondes. - Si les molécules se déplacent lentement, le détecteur va avoir l'impression d'en voir énormément. La surface du pic est proportionnelle à la quantité injectée (cela correspond à la concentration et au volume de solution injectée), à ε (coefficient d'absorption molaire de la molécule), à la longueur du trajet optique mais elle va être également proportionnelle à la vitesse de déplacement.

- Si maintenant nous avons les mêmes caractéristiques qu'au-dessus mais que les molécules se déplacent très rapidement, le détecteur va avoir l'impression qu'il n'y en n'a pas beaucoup. Donc nous allons avoir un pic électrophorétique qui va sortir plus tôt et qui sera beaucoup plus petit que le pic pour une molécule se déplaçant lentement.

Si on veut doser une espèce et que le temps de migration varie entre 2 injections cela va impacter le résultat et nous allons faire une erreur de dosage. Donc nous allons nous affranchir de ces différences de vitesse de passage dans le détecteur en divisant l'aire du pic par le temps de migration.

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La chromatographie est un phénomène de rétention. Nous injectons les solutés sur une colonne ils vont s'accrocher plus ou moins sur la phase stationnaire, à un moment donné ces solutés vont arriver à la limite de la phase stationnaire et ils vont sortir avec la vitesse de la phase mobile. Donc la vitesse de passage dans le détecteur est la même pour tout le monde simplement les solutés vont s'accrocher plus ou moins longtemps. La surface du pic va dépendre de la vitesse de passage dans le détecteur mais on sait qu'elle est constante.

Si on utilise un spectromètre de masse, la détection ne se fait pas sur le capillaire mais cela va se passer comme en chromatographie. Les solutés présents dans l'électrolyte vont sortir du capillaire et on va les envoyer en rajoutant un liquide. Dans ce cas, nous ne sommes pas obligés de calculer une aire corrigée mais nous allons exploiter les résultats en fonction de l’aire du pic.

Quand on fait de l'étalonnage interne, une fois que nous avons le paramètre d’intérêt nous allons tracer les variations du rapport de la réponse de la substance d’intérêt sur la réponse de l'étalon interne en fonction du rapport de la concentration de la substance d'intérêt sur la concentration de l'étalon interne. En TP nous prenons en compte l'aire corrigée.

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III) Conclusion

En électrophorèse capillaire nous allons pouvoir séparer toutes les molécules chargées. Donc cela va être applicable à des petits anions minéraux et organiques (ion chlorure, bromure, nitrate) mais aussi à des petits cations minéraux et organiques (calcium, sodium, magnésium, cuivre, zinc). Le plus souvent dans le domaine du médicament on va plutôt séparer des molécules organiques qui sont chargées ou neutres et de masse moléculaire faible. En électrophorèse capillaire, on va pouvoir séparer des biomolécules, de l'ADN, des protéines, des peptides car nous avons des molécules de charges variées et de tailles différentes.

La séparation des molécules neutres est possible. Normalement, les molécules neutres se déplacent toutes avec le flux électro-osmotique donc elles se déplacent toutes à la même vitesse mais cela est possible quand nous prenons un électrolyte de séparation avec une phase aqueuse, avec un tampon (exemple tampon des ions phosphates et hydrogénophosphate qui vont fixer le pH de l'électrolyte). Mais nous pouvons compliquer le système pour arriver à séparer des molécules neutres en faisant l'addition de micelle chargé. C'est pourquoi nous allons ajouter du SDS dans l'électrolyte de séparation. Qu'est-ce que la MEKC ? Dans le capillaire, dans l'électrolyte de séparation nous allons rajouter un tension actif (par exemple du sodium de laurylsulfate (= SDS)). Le SDS est un détergent avec une chaine aliphatique très longue, qui est hydrophobe. Il possède un groupement phosphate qui est chargé négativement.

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Si nous mettons beaucoup de ce tensioactif en solution, il va former des sphères (= micelles) car les molécules de tensioactif ont tendance à s'organiser entre-elles pour former comme des ballons où elles vont protéger les chaines hydrophobes en les cachant à l'intérieure de ce ballon pour avoir une solubilité maximale dans la phase aqueuse. Donc les chaines hydrophobes vont se retrouver à l'intérieure et les têtes hydrophiles à l'extérieure du ballon.

Si nous avons 2 molécules différentes et que nous travaillons à pH basique, ces molécules neutres ont des propriétés hydrophobes donc elles vont aller se cacher à l'intérieure des micelles. Comme nous avons 2 molécules neutres différentes elles n'ont donc pas le même caractère hydrophobe et donc elles ne vont pas avoir la même capacité pour aller se cacher dans les micelles. Plus la molécule est hydrophobe plus elle va se mettre dans les micelles. Lorsque nous allons appliquer la différence de potentielle aux bornes du capillaire, comme nous sommes à pH basique nous avons la présence d'un flux électro-osmotique. Donc toute la solution va avancer avec ce flux, mais les molécules qui n'ont pas d'affinité pour les micelles vont se déplacer à la vitesse du flux électro-osmotique. Les micelles anioniques ont une mobilité électrophorétique qui les entrainent vers l'anode. Donc les molécules qui se sont cachées dans les micelles anioniques vont être ralenties et c'est ce qui va permettre de les séparer des autres molécules neutres. Nous jouons donc sur un phénomène de complexation qui est sélectif.

Donc en électrophorèse capillaire nous pouvons tout séparer soit les molécules sont ionisées au départ mais si les molécules ne sont pas ionisées nous trouvons un artifice pour former des espèces ionisées qui permettront leurs séparations.

Dans le domaine du médicament, nous utilisons l'électrophorèse capillaire pour : – déterminer les teneurs en principe actif, – rechercher des impuretés, Nous utilisons une méthode orthogonale à la chromatographie, cela veut dire que c'est une méthode qui utilise un principe complètement différent. Par exemple : nous faisons une analyse en chromatographie mais il y a 2 pics qui sortent en même temps (donc nous avons l'impression que le produit est pure) sauf qu'il y a quelque chose de caché sous le pic du produit principal. Quand nous allons faire la même analyse en électrophorèse il y a très peu de chance d’avoir le même phénomène car nous allons jouer sur un principe de séparation différent.

Cette méthode est très utilisée pour aller déterminer la pureté énantiomériques de composé. Il y a beaucoup de médicament qui sont chiraux donc nous allons utiliser les sélecteurs chiraux qui sont des molécules caches, de taille différentes (c'est comme des micelles). Les énantiomères qui normalement ont les mêmes propriétés physicochimiques donc quand nous les mettons dans un environnement achiral ils vont toujours se déplacer de la même manière en électrophorèse. Les sélecteurs chiraux vont venir complexer les énantiomères de manière sélective, c'est ce qui va permettre de les séparer. 10/14

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Dans le domaine médico-légal, nous allons pouvoir utiliser l'électrophorèse pour : – la recherche de drogue, – le contrôle antidopage

En électrophorèse nous avons souvent des séparations qui sont beaucoup plus rapide qu'en chromatographie.

En chromatographie quand nous faisons de l'optimisation, nous commençons par faire varier la compétition de la phase mobile. Mais quand nous changeons la composition de la phase mobile il faut attendre 15 – 20 minutes que la phase mobile se soit bien répartie sur la colonne. En électrophorèse, nous remplissons le capillaire en moins d'une minute, nous pouvons faire tout de suite la séparation. Si ça ne fonctionne pas, on peut retravailler en moins d'une minute. Donc c'est une méthode qui est beaucoup plus souple et qui a beaucoup plus de perspective en terme d'optimisation, de séparation.