TEMA 2 - Apuntes 2 PDF

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TEMA 2: CONCEPTOS GENERALES Y MÉTODOS DE ESTUDIO: TINCIÓNES, TECNICAS CITOQUÍMICA, HISTOQUÍMICAS E INMUNOHISTOQUÍMICAS: TINCIONES: COLORANTES: 1714 Leeuwenhoek azafrán en vino. 1781 Fontana colorantes acido-básicos. A mediados del XIX se amplían mucho los colorantes unido al desarrollo de la industria textil. Suelen ser moléculas orgánicas con anillos aromáticas que absorben la luz visible por contener en su molécula cromóforos. Además tienen otra parte en la molécula capaz de unirse a los elementos celulares denominado auxocromo. Cromóforo: Son combinaciones de algunos de estos enlaces. N=N N=O C=N C=C C=O C=S C=NH2 Una molécula con anillo aromático unida a un cromóforo se le denomina cromógeno. Auxocromo: 1. Grupos básicos, fundamentalmente aminas: •

Tienen carga neta +. Se denominan colorantes básicos o catiónicos.

• 2. Grupos ácidos: •

Derivan de grupos sulfónicos, carboxílicos o hidroxilo de fenoles.

•

Su carga neta es negativa.

•

Se denominan colorantes ácidos o aniónicos.

•

Pueden estar como ácidos libres o sales.

Si un colorante tiñe en su mismo color se dice que es ortocromático. Si tiñe en otro color se dice que es metacromático. Society of Dyers and Colourists publica un catalogo de colores asignado a cada uno un Colour Index C.I. que informa sobre su estructura química. El catálogo informa sobre su nombre o su color. TIPOS DE COLORANTES: A.- SEGÚN LA ESTRUCTURA DEL CROMÓFORO: 1. Colorantes Nitrados o nitrosados: Son nitro –(NO2) o nitrosoderivados (-N=O). Uno de los más utilizados es el 2,4,6, nitrofenol o ácido pícrico (C.I. 10305) de color amarillo, soluble en agua y alcohol.

2. Colorantes Azoicos: Contienen un, dos y raramente 3 grupos –N=N- (azo) uniendo anillos adyacentes derivados del benceno o el naftaleno. Aniónicos (ácidos): Orange G (C.I. 16230). Catiónico (Básico): Janus Verde (C.I. 11050). Lipocromos (solubles en Lípidos):  Sudan Negro (C.I.26150).  Oil Red O (C.I. 26125).  Hidrosolubles (vira a azul PHC=O-): Presenta una estructura con tres anillos y cromóforo variable.  Fluoresceína sódica (C.I. 45350).  Eosina Y (C.I. 45380).  Eosina B (C.I. 45400).  Pironina B (C.I. 45010).  Rodamina B (C.I. 45170). Muchos son fluorescentes y sirven para marcar proteínas (Isotiocianato de fluoresceína, FITC). 5. Derivados de la Acridina (>C=N-): Son similares a los xantenos pero con un nitrógeno en lugar de un oxígeno como enlace de los anillos bencénicos.  Acriflavina (C.I. 46000).  Acridina (C.I. 46005). El naranja de acridina emite fluorescencia diferente cuando está unido al ADN o al ARN. 6. Derivados de aminas quinónicas: Por los grupos cromófobos se clasifican en: o

Derivados oxacínicos:

o

 Galocianina (N.I. 51030).  Azul Nilo (N.I. 51180).  Violeta de cresilo (s/n).  Orceina (s/n). Derivados tiacínicos:      

Tionina (C.I. 52000). Azul de Metileno (C.I. 52015). Azur A (C.I. 52005). Azur B (C.I. 52010). Azur C (C.I. 52002). Azul de Tolouidina (C.I. 52040).

o

Derivados acínicos: 

Rojo neutro (C.I. 54040)

7. Derivados de diaril y triarilmetanos (C=NH): Los más importantes son los amino triarilmetanos. Los más simples son los trifenilmetanos:  Pararosanilina (C.I. 42500).  Nueva Fucsina (C.I. 42 520).  Cristal violeta (C.I. 42555).  Verde rápido (C.I. 42053).  Verde de metilo (C.I. 42585).  Fucsina ácida (C.I. 42685).  Azul de Coomasie brillante (C.I.42660). 8. Derivados de las Ftalicianinas: Derivan de un sistema de cuatro moléculas de benceno en anillo alrededor de un átomo de cobre (recuerda al hemo). 

Azul Alcián 8G (C.I. 74240).

9. Flavonoides: El cromóforo es la flavona.  

Hematoxilina (C.I. 75290). Brazileina (C.I. 75280).

B.- SEGÚN LA ESTRUCTURA DE AUXOCROMO: 1. Colorantes básicos o catiónicos: Se fijan a los ácidos por lo que tiñen núcleos y carbohidratos ácidos (Axzul de metileno, Fuscina básica, hematoxilina…). 2. Colorantes básicos o aniónicos: Se fijan a las estructuras básicas por lo que se usan para teñir citoplasma y colágeno (eosina, Orange G, fuscina ácida…).

TINCIONES MÁS UTILIZADAS: 1. HEMATOXILINA-EOSINA: Tiñe todas las estructuras celulares contiene un colorante para estructuras ácidas (núcleo) la hematoxilina y otro para estructuras mas básicas (componentes extracelulares) la eosina. Es compatible con prácticamente todos los sistemas de fijación. Existen varios tipos dependiendo de la hematoxilina utilizada. Se usa desde hace más de un siglo y sigue siendo la tinción básica. La hematoxilina tiñe los núcleos en azul y la eosina tiñe las proteínas de rosa no específico.

a) Hematoxilina: Debe oxidarse la extraída del árbol (Hematoxylon campechianum). Si se hace de forma natural se oxida en semanas o meses. Puede oxidarse de forma artificial. La hematoxilina obtenida directamente tiene poca afinidad por los tejidos se le añaden mordientes lo que determina varios tipos con distintas afinidades tisulares y propiedades: •

Alumínica: cambia de rojizo a azul con pH>6 .

•

Férrica: muy resistentes al ácido. Se usa para estudiar mitosis.

•

Fosfotungstica: tinción de estriación de músculo, células gliales, cilios entre otros.

•

Plúmbica: estudio de glándulas endocrinas.

b) Eosina: Es un derivado halogenado del xanteno. Dependiendo del número de Br que contenga puede ser: Y con 4 y B con 2. 2. GIEMSA: Es una mezcla de colorantes: •

•

Catiónicos: o

Azul de metileno.

o

Azur A.

o

Azur B.

o

Eosina.

Aniónicos:

Se utiliza en hematología por diferenciar los gránulos de los granulocitos. Diferencia células endocrinas. 3. PAPANICOLAU: Suele emplearse en extensiones citológicas (carcinoma de cérvix) y otros fluidos corporales. Está constituido generalmente por: •

Hematoxilina alumínica.

•

Eosina y Verde brillante (tiñe el moco).

•

Orange G (queratina)

A pH < 3 sólo tiñen hematoxilina y orange G por encima comienzan a teñir la eosina Y y el verde brillante. El pH óptimo para todos los componentes 6,5.

4. TRICRÓMICOS: Tienen como finalidad la coloración selectiva del colágeno tiñendo además el resto de las estructuras. Están formados por: •

Colorante base P.ej. Hematoxilina férrica.

•

Un colorante aniónico para las fibras p. ej.. Azul de anilina o Verde rápido.

•

Otro colorante aniónico para citoplasmas p. ej Fuscina y/o Ponceau 2R (C.I. 16150).

•

Un colorante heteropoliáceo: ac. Fosfomolibdico (PMA) o Ac fosfotungstico (PTA).

Técnica tricrómico de Masson:

Colágeno: verde, músculo: pardo-rojizo; citoplasma rosa.

Conjuntivo: verde; muscular: pardo- rojizo; epitelial: rojo-rosa.

5. IMPREGNACIONES ARGÉNTICAS: Se llaman impregnaciones a aquéllas tinciones que se busca crear precipitados metálicos sobre las estructura a teñir. Se usan sales metálicas como el cloruro áurico o el nitrato de plata. Históricamente la impregnación argéntica fue decisiva para el estudio del tejido nervioso. Fueron descritas por Golgi y perfeccionadas por Cajal. Se usa el nitrato de plata para obtener el precipitado. Destacan prolongaciones en las células.

6. TINCIONES VITALES Y DE EXCLUSIÓN: Colorantes vitales son aquéllas que se utilizan en células vivas y captan el colorante por endocitosis. Sangre: Rojo neutro y verde Janus. Hueso. Tetraciclinas, alizarina Colorantes de exclusión sólo los captan las células muertas presentes en un cultivo. La membrana no funciona como barrera de entrada. Azul tripán.

7. TINCIONES PARA ELEMENTOS SUBCELULARES: •

Núcleo: En hematoxilina, carmín acético u orceína acética.

•

Nucleolo, RER u cuerpos de Nissl: Verde metilo-pironina.

•

Mitocondrias: Técnica de Fucsina de ltmann (rojo mitocondrias).

•

Aparato de Golgi: Impregnaciones argénticas.

•

Gránulos de secreción: Método de Ann: eosina+azul de metileno+ orange G.

•

Vacuolas de fagocitosis: Tinta china.

8. TÉCNICAS CITOQUÍMICAS E HISTOQUÍMICAS: Son técnicas que se usan para demostrar la presencia de determinadas moléculas en los tejidos por sus características químicas. A. TECNICAS PARA DETECCIÓN DE POLISACÁRIDOS: a) Técnica de PAS: Se utilizan dos reactivos principales una vez fijado con Formol, Bouin o Carnoy: el ácido peryódico y el reactivo de Schiff que es un derivado incoloro de fucsina básica después de tratarla con ácido sulfuroso. Esta técnica se realiza en dos pasos: 1) Se oxida el tejido con á. peryódico formando grupos aldehido. 2) Estos grupos aldehido se visualizan con el reactivo de Schiff. Hay que hacer controles para detectar falsos positivos p. ej. omitir la oxidación. b) Tinción con azul alcián: Este colorante tiñe mucopolisacásidoa ácidos. El grado de reactividad del colorante depende del pH, lo que permite distinguir diferentes mucopolisacásridos. pH = 1 Sólo tiñen mucopolisacáridos ácidos sulfatados. pH = 0,5 Sólo los muy sulfatados (condroitín sulfato sódico).

c) Técnica de las lectinas: Son proteínas o glicoproteínas de origen no inmune capaces de unirse a determinados azúcares, aglutinar células y precipitar glucoproteínas. Son muy específicas a unirse cada una a un determinado carbohidrato e identificar pequeñas diferencias en la cadena glucídica. Permiten identificar tipos celulares por los carbohidratos que poseen así como alteraciones celulares.

B. TECNICAS PARA DETECCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS: a) Técnica de Feulgen: Detecta ADN y se basa en el reactivo de Schiff. Puede usarse cualquier fijador excepto Bouin. Se realiza también en dos pasos: 1) Se hidroliza el tejido con CLH a 60ºC (el tiempo depende del fijador). 2) Se visualiza el ADN con elo reactivo Schiff. El ARN permanece incoloro. b) Tinción con verde de metilo y pironina: El verde de metilo tiñe el ADN y la pironina el ARN. Con esta técnica se descubrió que el nucleolo esta formado fundamentalmente por ARN (Test de Brachet).

9. TÉCNICAS HISTOENZIMOLÓGICAS: Tienen como función identificar determinada actividad enzimática en un tejido y demostrar in situ su actividad. •Fosfatasas: o

alcalinas: sales de diazonio.

o

ácidas: técnica del glicerofosfato.

•Peroxidasas: diaminobencidina. •NADPH diaforasa: Sales de tetrazolio. •ATPasas: Calcio y sales de cobalto. Diferencia las fibras musculares.

10. TÉCNICAS INMUNOHISTOQUÍMICAS: Se basan en la localización de antígenos in situ mediante la utilización de anticuerpos monoclonales y policlonales. a) Anticuerpos policlonales: •

•

Ventajas: o

Mayor espectro de reactividad por contener anticuerpos frente a varios epítopos.

o

Son más fáciles de producir.

Inconvenientes: o

Reconocen varios epítopos de la misma molécula.

o

Es imposible reproducir los resultados de una inmunización. Cada antisuero es único y limitado.

o

Su purificación es laboriosa.

b) Anticuerpos monoclonales: •

•

Ventajas: o

Suponen una fuente ilimitada de anticuerpos ya que las células de los producen pueden congelarse y descongelarse.

o

Muy específicos reconocen solo un epítopo.

o

No hay que purificar el Ag para la inmunización.

Inconvenientes: o

La fijación puede alterar el epítopo y sólo hay uno.

o

Su alta especificidad limita a especies concretas.

o

El proceso de obtención es muy complejo y caro.

o

Deben utilizarse concentraciobes mayores de Ac.

c) Métodos: •

Directos: o

Se marca el antisuero primario.

o

Inconvenientes: o

Es necesario marcar todos los sueros primario.

o

Este proceso puede alterar el antisuero.

o

Es muy caro y tedioso.

Indirectos:

•

o

Se obtienen antisueros marcados anti Ig.

o

Ventajas: o

Evita marcar los antisueros primarios y su posible alteración.

o

Son específicos de especie por lo que valen para muchos antisueros primarios.

o

Son más sensibles porque a cada molécula del Ac primario se pueden unir varios secundarios por ser policlonales.

d) Clasificación en función del marcador: •

Fluorocromos: Las muestras se observan con un microscopio de fluorescencia: técnicas de inmunofluorescencia.

•

Enzimas: Las muestras se observan por técnicas histoquímicas: técnicas inmunoenzimáticas. Suelen utilizarse la peroxidasa y la fosfatasa.

•

Oro coloidal: Suele utilizarse en ME....