Elettroforesi - Approfondimento su questa tecnica di laboratorio PDF

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Approfondimento su questa tecnica di laboratorio...

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Per dna/rna, l'apparato è costituito da una cella (o vasca elettroforetica) disposta orizzontale, un generatore di corrente a cui la cella si collega con un coperchio e un apposito alloggiamento per gel (slitta o lettino). La cella non è altro che una vasca di materiale inerte ai cui poli opposti sono presenti due elettrodi, due filamenti di platino, oro o metallo conduttore ed inerte. Una volta connesso il generatore un elettrodo diverrà polo + e l'altro il polo -. Nella cella elettroforetica viene posto un tampone: soluzione acquosa di uno o più sali, a concentrazione nota, che conferiscono alla soluzione stessa un pH costante e creano l’ambiente ideale di reazione, oltre a consentire il passaggio di corrente tra i due .Per il dna ed rna è possibile utilizzare soluzioni di TBE (T= Tris B= Acido Borico E=EDTA), con funzioni rispettivamente di tamponare il pH, liberare gli ioni che permetteranno il passaggio della corrente e preservare il dna dalla denaturazione. Quando si attiva la corrente, al catodo (polo -) si producono ioni ossidrile e idrogeno, mentre all'anodo (polo +) si producono ioni idrogeno e ossigeno. Le molecole cariche in soluzione si sposterebbero verso il polo opposto senza possibilità di fissarle su un supporto per successiva analisi. Serve pertanto un gel, un supporto gerlatinoso che funga da setaccio molecolare, da inserire all'interno della vasca elettroforetica e su cui siano caricati i campioni. Per dna ed rna si utilizzano in genere gel di agarosio oppure poliacrillamide, a seconda della dimensione dei frammenti che si vogliono separare (agarosio ha un potere risolutivo, ossia una capacità di separare frammenti di dna simili per lunghezza, inferiore alla poliacrillamide, che è utilizzata per frammenti più piccoli di dna e ancheperleproteine). L’agarosio è uno zucchero estratto da un’alga marina del genere agar, ed è un polimero di unità costituite da D-galattosio e 3,6anidro L-galattosio. Sciolto a caldo (a ebollizione) ad una concentrazione tra 0,8% e 2% in TBE, l'agarosio soluzione raffreddandosi polimerizza reticolando e formando una gelatina. I gel vengono fatti solidificare a temperatura ambiente in appositi stampi rettangolari, lasciando inserito a una estremità dello stampo un pettine dotato di denti rettangolari. Quando il gel è solidificato, il pettine viene rimosso e resta scavata sulla superficie del gel una fila

di 'pozzetti' rettangolari. Una volta immerso il gel nella soluzione salina all'interno della cella elettroforetica, i pozzetti sono immersi nel liquido conduttore (TBE) almeno 1-2 mm sotto la superficie del liquido. Da notare che i pozzetti devono essere posti all'estremità negativa della vasca elettroforetica, in quanto lo spostamento (migrazione) degli acidi nucleici avverrà verso il polo +. A questo punto avviene il caricamento nei vari pozzetti dei campioni, utilizzando siringhe o micropipette, e il coperchio della cella viene chiuso. Quando la corrente è settata, ad un voltaggio generalmente sui 100 V, inizia la co corsa rsa elettrof elettroforetica oretica oretica: i frammenti di DNA o RNA lentamente migrano verso il polo positivo (DNA e RNA al pH leggermente basico conferito dal tampone Tris sono carichi negativamente) muovendosi tra i reticolati dell'agarosio. Durante lo spostamento dei frammenti, i parametri che ne influenzano la velocità di migrazione nei gel sono: -Dimensioni del filamento di DNA/RNA (lunghezza del frammento) -Concentrazione di agarosio -Conformazione dell'acido nucleico (DNA circolare tipo plasmide riesce a spostarsi più velocemente di un frammento lineare di pari coppie di basi di lunghezza in quanto si avvolge su se stesso) -Voltaggio applicato (a un maggior voltaggio si avrà maggiore velocità di migrazione di tutti i frammenti, non è possibile però con l'agarosio superare i 150-200 V perchè si rischia di sciogliere il gel) -Temperatura (infuenza l'energia cinetica di tutto il sistema) -Composizione del tampone di elettroforesi In genere una corsa elettroforetica può durare 20-30 minuti a 100 V per gel 0,8% agarosio e frammenti di 100-1000 coppie di basi. Staccata la corrente, i frammenti di DNA/RNA restano incastrati nelle maglie di agarosio. Non sono visibili ad occhio, a meno di colorare i frammenti di acidi nucleici con coloranti intercalanti (bromuro di etidio, sybr green, gel red e altri). I coloranti intercalanti sono molecole che, legandosi alla doppia elica, formano un complesso fluorescente e rendono così visibile il campione sottoposto a intensa luce UV. E' possibile inserire il colorante direttamente nel gel all'atto della sua preparazione, quando si scioglie l'agarosio nel TBE, oppure immergere il gel dopo la corsa

elettroforetica per qualche decina di minuti in una soluzione del colorante. Il gel colorato a questo punto viene posto su una lampada UV (trans trans transilluminatore illuminatore illuminatore), che può essere anche collegata tramite pc a strumenti per l'acquisizione delle immagini. Il risultato mostra bande (o bandeggi) rettangolari (forma del pozzetto) luminose. Ogni bandeggio è costituito da tutti i frammenti di DNA/RNA della stessa lunghezza (indipendentemente dalla sequenza in basi azotate). E' evidente che le bande che si spostano maggiormente dal pozzetto alla fine della corsa elettroforetica sono costituite dai frammenti più piccoli di acidi nucleici, che riescono a passare più agevolmente tra le maglie molecolari del gel durante lo spostamento verso il polo positivo.Il potere di risoluzione di un gel è la capacità di separare frammenti di lunghezza differente, ed è tanto maggiore quanto minore è la differenza tra le molecole separate (la massima risoluzione si ha per gel di poliacrillamide capaci di separare frammenti differenti fra loro per 1-2 coppe di basi)....