LEZ 2.1 Luconi Elettroforesi Bidimensionale PDF

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LEZ 2.1 Luconi Elettroforesi Bidimensionale...

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ELETTROFORESI BIDIMENSIONALE L’altra volta si è visto come si può separare un miscuglio, una sospensione di proteine su una matrice di poliacrilammide utilizzando una caratteristica sola delle proteine che è quella del PM con ottenimento di bande che corrispondo a fasce di PM dove esistono più di una proteina quindi la separazione non è così penetrante. Invece l’elettroforesi bidimensionale (2DE), sfruttando la carattestica del PM e del punto isoelettrico PI, permette una risoluzione migliore. Si ottengono sempre sul gel di poliacrilammide degli spot dove la proteina contenuta navrà un PM specifico e un punto isoelettrico (PI) specifico e quindi è molto difficile che esistano due proteine che hanno stesso PM e PI (praticamente impossibile). Quindi queste tecnica permette una risoluzione molto maggiore e viene utilizzata per l’identificazione delle proteine a partire da un miscuglio quando non sapete cosa andate a cercare. La 2DE è estremamente specifica, risolutiva e permette anche di studiare non solo la proteina in se ma anche tutta la classe di alcune modificazione post-traduzionali (fosforilazione, metilazione, glicosilazione). Questo perché vedremo che soprattuto le fosforilazioni, che modificano minimamente il PM, modificano pesantemente il PI quindi sarà possibile vedere una proteina nei suoi vari stati di fosforilazione proprio perché avremo tutta una serie di spot uno accanto all’altro con lo stesso peso molecolare, perché il gruppo fosfato non modifca significativamehte il PM, ma modifica significativamente il PI. La prima dimensione permette una separazione sul punto isoelettrico. Vi ricordo che il PI è quel valore del pH dell’ambiente in cui la carica netta della proprietà è zero. Le proteine sono cariche, a seconda del radicale che hanno avranno una carica netta di un certo valore, il PI in cui quella carica netta è uguale a zero. Quindi fondamentalmente il pH del radicale della proteina è il PI. La separazione avviene su una striscia sempre di acrilammide, considerate che la matrice della separazione delle proteine (mono o bidimensionale) è sempre poliacrilammide. Iin questo caso però siccome bisogna separare sulla base del PI, quindi di un pH, nell’acrilammide sono state fatte polimerizzare una serie di proteine che pHaccano che si chiamano immobiline/anfoline. Avremo un gel trasparente ma con un gradiente di pH perché durante la preparazione di questa strisciolina si sono messi uno accanto all’altra anfoline a crescente pH,. Avete una striscia con un pH che può andare da 1 a 15, oppure si possono avere (per fare una separazione molto più puntuale) range da 3 a 4, quindi un punto di pH, a seconda di quelo che dovete fare. È chiaro che se dovete partire da una separazione di un proteoma, quindi del contenuto delle proteine della cellula/tessuto/organo, è chiaro che dovrete partire da una range il più ampio possibile mentre se dovrete separare in modo molto specifico una proteina o un gruppo di proteine di cui sapete il range del PI allora sceglierete la strip adatta a separare il più possibile. Si va quindi dalla prima separazione su punto isolettrico, ricordatevi che per muovere le proteine in sospensione si applica sempre un campo elettrico quindi avrempo sempre un elettrodo con il polo positivo e il polo negativo. (Slide 63 è un video che non mi si carica ma faceva vedere separazione in cui proteine cariche neg si muovono verso polo pos e quelle cariche pos che si muovono verso il polo neg e si muovono fino a che non trovano il pH che equivale al loro PI e in quel punto di pH precipiteranno.) Quindi in questo caso la separazione non è come nella mono verso una sola direzione, polo positivo, qui le proteine si possono muovere dx/sx polo pos/polo neg in base alla loro carica e si fermano là dove c’è il pH che equivale al PI.

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Questa striscia viene poi applicata su di un gel esattamente identico a quella della monodimensionale,quindi la seconda separazione viene fatta in base al peso molecolare. In questo caso avremo solamente il running gel non c’è da applicare il pettinino, ricreare i pozzetti ecc ma viene applicata direttamente la strip ortogonalmente dove avrete separate tutte le proteine per punto isoelettrico. A questo punto si riapplica il campo elettrico in modo tale da avere il polo positivo in basso. Le proteine che sono presenti sono tutte a carica netta zero perché sono bloccate là dove il pH corrisponde a zero. Quindi vanno rese, come nella monodimensionale, tutte cariche negativamente se no non si muoverebbero né verso il polo positivo ne verso il polo negativo. Questo viene fatto attraverso l’SDS come si faceva nella monodimensionale quindi avvolgi ogni proteina con una faccia di cariche negative. A questo punto a ognuna di queste protiene si può riapplicare la differenza di potenziale in modo che migrino tutte verso il polo positivo, come nella monodimensionale. A questo punto vedete le proteine tutte separate. Se aveste fatto solo la monodimensionale alcune proteine sarebbero migrate nella stessa fascia di peso molecolare di altre proteine con PI differente e non si sarebbe potuto scindere le due proteine. Invece la bidimensionale sfrutta quest’ulteriore caratteristica che è veramente unica della proteina e permette di ottenere degli spot proteici in cui molto probabilmente avete solamente una proteina, piuttosto che una serie. Infatti, questa tecnica viene utilizzata come preparazione per la spettrometria di massa. Come si lavora? La strisciolina di gel con le anfoline viene applicata in una sorta di contenitore allungato di ceramica, il campione (vedete la pipetta) viene applicato ovunque (dove volete in cima, in fondo o al centro) basta che il gel sia imbevuto bene del campione applicato quindi non vada a secco da una parte; il volume del campione deve essere tale da ricoprire in maniera uniforme il gel. Dopo di che, quando applicherete la differenza di potenziale cliccando queste barrettine, con la strip all’interno di questa struttura (è un creatore di campo elettrico) crea, appunto, un campo elettrico in modo tale da avere polo positivo e polo negativo e potete separare queste striscioline fino a 12/20 strisce. Quindi potete applicare tanti campioni in modo separato e ottenere le strisce che riapplicherete su un'altra serie di gel. Questo IPGphor è quello più utilizzato perché è tutto computerizzato, il Multiphore non si usa più.

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Per la seconda dimensione la strisciolina la applicate in cima direttamente dopo averla tenuta in SDS. Non vi è lo stacking gel (nella monodimensionale serviva per creare i pozzetti ma serve anche per assemblare le proteine già in fasce di peso molecolare in modo tale da ottimizzare al meglio la risoluzione nella corsa) perché qui sono già ottimizzate dato che sono divise per PI quindi non c’è una concentrazione di proteine che poi potrebbero darvi una risoluzione pessima nella separazione per PM. In alto nell’immagine vi è il colorante usato per apprezzare la corsa quando pan piano si separeranno. Anche in questo caso come nella monodimensionale è bene mettere uno standard (è creato un pozzetto a lato del gel che viene fatto polimerizzare come nella monodimensionale) per avere un riferimento: in base alla sua separazione, quindi proteine colorate a PM noto, sarà possibile identificare tipo battaglia navale lo spot in un punto x che avrà un PM specifico e un PI specifico. In una di quelle barrettine che mettiamo nella separazione, quindi in una di quelle strip, ci sarà uno standard quindi vi saranno proteine con PI noto che si separeranno in questa diluizione e quindi vi permetterà poi, una volta separato il campione, riapplicando la strip con lo standard nella parte alta del gel di sapere nel punto x che PI vi è. In questo modo potete separare e avete già un’idea delle caratteristiche del singolo spot, ricordate che non sapete che proteina avete nello spot perché ora siamo solo nella fase di separazione. Colorazione identica alla monodimensionale: silver stain, comassie, fluorocromi (tutto uguale), sono per ordine di sensibilità (argento nell’ordine dei pico) (isotopi radioattivi non si usano più). Questo gel (analogo alla monodimensionale) potete colorarlo o trasportarlo di nuovo su una nitrocellulosa, su una membrana laminare e applicare un’analisi di tipo western: cercare all’interno di quella costellazione di spot la vostra proteina di interesse (dovete sapere a priori che anticorpo utilizzare). Analogamente alla monodimensionale, vengono trasferiti dal gel alla membrana di nitrocellulosa gli spot proteici esattamente nelle stesse posizioni: si applica la differenza di potenziale e dal gel le proteine si spostano verso la membrana su cui vengono fissate ed avrete esattamente la fotografia delle proteine traferite su membrana (proteine cariche negativamente e polo positivo nella direzione della membrana). A questo punto ripartite con la tecnica del western: incubate con il bloccante, mettete il primario, il secondario coniugato ecc. Quello che vi permette questa tecnica è di avere separato lo stesso pool di proteine su due gel in parallelo, quindi fatta la bidimensionale su due gel in parallelo: uno lo utilizzate nel western, l’altro lo lasciate colorandolo. A questo punto sovrapponendo il risultato del western (ipotetico pallino che sapete per esempio che è la fosfatasi alcalina) sapete a questo punto ritrovarla nel miscuglio di proteine separate del gel e quindi potete tirarla fuori dal gel e andarci a fare una spettrometria di massa (lo fa uno strumento computerizzato).

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Con la bidimensioanle si possono fare le stesse cose della monodimensionale ma avete una risoluzione molto maggiore perché nello spot sapete che avrete solo quella proteina, fra l’altro rivelata dall’anticorpo con western. Questo tipo di analisi con quest’altissima soluzione permette di fare comparazione fra campioni diversi: invece che caricarli nei pozzetti controllo/stimolo o controllo sano/controllo malato in questo caso separerete i due campioni di cui dovrete confrontare il proteoma o la singola proteina facendo quello che si chiama “differential display”. Potete separare i vostri due campioni (nell’immagine colon normale/poliposi intestinale) nella bidimensionale ed ottenere dopo colorazione una costellazione di questo tipo e andate a vedere le differenze tra tessuto tumorale e tessuto sano, ormai non si va più nulla ad occhio umano ma fa tutto uno strumento. Nell’immagine si vanno a confrontare due punti identici per PI e PM in due campioni da comparare, in questi due punti potete veder che il campione sano ha questi quattro spot che non sono presenti o sono presenti ma spostati o espressione in maniera minore nel campione tumorale e quindi potete già avere una differenza di tipo qualitativo, potete identificare gli spot che si muovono in un campione sano rispetto ad un altro perché si muovono negli stessi ambiti di coordinate cioè PI e PM. Questo è il modo con cui si vanno a ricercare i biomarcatori, cioè confrontando una situazione sana ed una situazione patologica; si va a vedere non sapendo ancora cosa ci sia lì dentro ma vedete semplicemente che nella situazione patologica c’è un pattern o di espressione di livello o di tipo qualitativo (cioè c’è e non c’è) diversa in alcune zone del gel. Questo permette di fare ricerca di biomarcatori. Però questo tipo di analisi: comparare il proteoma di due strutture separate su due gel fisicamente separati (corsi nello stesso tempo quindi con la stessa lastra di separazione ecc. ma fisicamente sono due gel diversi) può dar adito però a degli artifizi. Può darsi, cioè, che questa proteina, che nell’immagine vedete come un pallone e nell’altra poca, in realtà non sia meno espressa nel tumore o in quel che sia ma semplicemente la preparazione del gel che ha permesso la separazione del campione tumorale ha auto un inconveniente per cui è migrata meno quantità di quella proteina, quindi questa differenza che si vede dall’immagine non è una differenza intrinseca ma semplicemente è un artifizio dovuta ad un difetto/qualche cosa che è avvenuto nella preparazione del gel. Per essere sicuri che la comparazione sia fatta esattamente nelle stesse condizioni (ritardo in caso si verifichi in tutte e due le situazioni) hanno sviluppato DIGE (differential in gel elettrophoresis ) cioè la tecnica per cui fate la separazione differenziale nello stesso gel. • I campioni vengono caricati fino a 7 nello stesso gel. • Sono stati premarcati con un fluorocromo quindi le varie proteine derivanti da campione tumore maligno/benigno e tessuto sano vengono fatti migrare quindi separare con elettroforesi bidimensionale. • Verranno comparati i contenuti degli spot uno derivante dal benigno, uno dal maligno e uno dal tessuto sano nella stessa posizione identificati perché emetteranno un fluorocromo diverso. Lo spot è lo stesso, la posizione è la stessa con lo stesso PM e stesso PI però vengono separati esattamente nello stesso gel quindi se succede qualcosa al gel ne risentono tutti e tre i campioni in modo identico. Le differenze quindi sono reali. 4

Esempio a dx: stesso campione separato su 6 gel diversi, quindi sono esattamente le stesse proteine perchè il campione è lo stesso. Vedete nel campione • bad guy sono quelli che variano e siamo nello stesso campione ma su gel diversi, • nice guy sono quelli che sono esattamente lo stesso spot con la stessa quantità quindi con la stessa emissione in tutti e 6 i gel separati. Vuol dire che qui fra questo campione e questo campione è successo qualcosa nei due gel per cui da una parte è migrato più campione, nell’altro gel meno. Se fate il differential display (DD) utilizzando gel diversi potreste avere questa situazione. Con il DIGE (esempio a 2 campioni): • avete un controllo che marcherete in verde, un tumore che marcate in rosso quindi le proteine nel vostro miscuglio saranno marcate con un fluorocromo diverso a seconda del campione • Metto tutto insieme e questo campione x viene separato con la bidimensionale • Il gel (trasparente) viene eccitato prima perché si possa vedere l’emissione separate su gel che sono controllo poi viene eccitato per il fluorocromo che marca il proteoma tumore e vedrete lo stesso pattern però relativo alle proteine che appartengo al tumore, sono esattamente nello stesso punto ma quelle verdi sono del controllo e quelle rosse del tumore. Lo standard interno è un altro punto di forza di questa tecnica perché permette di fare delle quantizzazioni assolute. Lo standard interno deriva dalla somma di tutti campioni che volete analizzare in una sessione di lavoro (es 20 campioni sani e 20 campioni malati) e che non potete caricare tutti sullo stesso gel e dovete frazionare la separazione su gel diversi. Lo standard interno è un campione generato dalla somma di quantità identiche di tutti i campioni che voi volete analizzare (es 5 microgrammi da tutti i 40 campioni e mettete tutto insieme), somma equi-quantitativa di tutti i campioni che avrete. Questo campione ve lo portate dietro come ancora in tutti i gel che separerete. Lo standard interno sarà identico in tutti i gel che farete; alla fine degli esami, quando andrete a quantificare questo DD, andrete a vedere in un gel il pattern di emissione del controllo non tanto verso il pattern di emissione del tumore ma valuterete lo spot del controllo vs lo spot corrispondente dello standard interno che è uguale sempre in ogni gel e lo spot del tumore vs lo standard interno. La quantizzazione non la farete mai un campione contro l’altro da comparate ma al meno della differenza di quantità con lo standard interno che è uguale in tutti i gel. Quindi i DD che state facendo in ogni singolo gel fra i due campioni che sono separati in quei singoli gel sono comparabili fra di loro perché sono tutti calcolati a meno dello standard interno che è sempre lo stesso. Da una parte separare campioni sullo stesso gel vi permette di essere sicuri che la differenza che state vedendo è vera, dall’altra il portarsi dietro questo standard interno (non vi interessa cosa ci sia ma è importante che ci sia sempre tutta la somma dei campioni e che voi carichiate nel gel sempre la stessa quantità di standard interno) vi permetterà di svincolare il fatto che state confrontando 3 campioni ad esempio sullo stesso gel e 3 su un altro. In teoria potreste caricare su un gel tutti i controlli e su un gel tutti i tumori fare la differenza su tutti i campioni

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al meno dello standard interno e alla fine potete avere una differenza assoluta fra tutti i controlli e fra tutti i tumori. Immagine a dx abbiamo questi ipotetici quattro campioni che vengono corsi a due a due su due gel separati, lo standard è dato dalla somma di tutti e quattro i campioni. Una volta separati vedete per esempio campione 1 e campione 2: il campione blu è l’emissione dello standard interno che vedete nel sample 4 è molto di più degli altri sample, quando andrete a comparare lo stock che è presente qui contro questo standard interno avrete un risultato che potrò essere rapportato a quello in altri gel. Quindi se, per esempio, in un punto vi arriva più standard interno rispetto al primo gel vuol dire che in questo gel vi è stato un problema per cui tutta questa fascia di proteine qui si è arricchita di campione quindi quando andrete a dire che questa proteina in questo campione 4 non c’è siete sicuri che non c’è nel quantitativo relativo allo standard interno. Qualsiasi cosa succede al vostro gel che modifica anche lo spot dello standard interno non c’è problema perché siete sicuri che lo standard interno è la stessa concentrazione presente negli altri gel e questo vi svincola da tutti i difetti tecnici della preparazione dell’elettroforesi stessa. Si possono correre insieme tanti campioni quanti sono i fluorocromi a disposizione (slide 77 fluorocromi più usati le cianine), chiaramente ogni fluorocromo viene identificato dal picco del proprio spettro di emissione quindi la cosa importante è che per vedere in modo distinto i fluorocromi e per determinare il numero di fluorocromi massimo da caricare sul gel è necessario che gli spettri di emissione siano ben distanti. Ad oggi si riesce a far correre 8/7 campioni, ricordatevi che un fluorocromo deve essere sempre dedicato allo standard. Mi permette veramente di velocizzare, questo è importante fare insieme campione riconducibili perché in uno screening che presenta ad esempio un biomarcatore di una patologia è importante screnare un sacco di campioni e un sacco di marcatori. Tutta questa roba indica un tempo e anche una disponibilità di campione quindi la possibilità di comparare fra di loro con anche meno gel permette di risparmiare e fare uno studio con una numerosità tale da dare un risultato solido. L’eccitazione del gel per il fluorocromo che identifica standard poi controllo poi tumore lo fa un sistema tipo fotocopiatrice: sullo schermo mettete gel viene chiuso il tutto, vi sarà un’eccitazione sequenziale (prima per il singolo picco che identifica i controlli poi il pattern del tumore ecc.), la macchina detecta emissione sequenziale di questi pattern legati ai campioni e alla fine mi dà il contenuto differenziale fra i vari campioni quindi voi non dovete fare nulla a mano. Vantaggi: in generale 2DE permette di separare/risolvere fra di lor proteine anche molto vicine, è estremamente affidabile, relativamente economica fino a che si viaggia sull’elettroforesi bidimensionale non differential display perché i fluorocromi costano molto. Permette di superare gli svantaggi della riproducibilità, della separazione; si compra tutto già fatto quindi anche gel strip per separare per PI è tutto prodotto commercialmente e quindi sono effettivamente riproducibili questi sistemi. Esempi di applicazione soprattutto della proteomica bidimensionale della differential display della DIGE soprattutto per identificare biomarcatori. In generale i biomarcatori non sono solo proteine ma possono essere anche altre molecole di altra natura che caratterizzano quello stato patologico/funzionale;un biomarcatore per essere utilizzabile ed essere un buon biomarcatore 6

deve essere facilmente prelevabile il campione dove si va a ricercare il biomarcatore (esempio possibilità di identificare un tumore da un semplice prelievo di sangue permette di fare un indagine non invasiva come ad esempio andare a fare la pet quindi andare...