LEZ Scelta Metodica Opportuna PDF

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lezione prof cevenini....

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SCELTA METODICA OPPORTUNA Domande fondamentali 1) la mutazione è causata da poche mutazioni note oppure tantissime mutazioni ciascuna poco frequente Potremmo trovarci davanti a un caso in cui una malattia è causata da una sola mutazione come l'acondroplasia oppure con un numero di mutazioni Ben caratterizzati come la beta-talassemia Quindi è chiaro che un piccolo numero di mutazioni note da analizzare sono un discorso 2)potremmo trovarci davanti a un caso in cui le mutazioni possibili sono il numero enorme e ognuna di esse equamente poco probabile rispetto alle altre e quindi tanto vale fare nel primo caso va fatto il mutation screening che permette di fare la ricerca di poche mutazioni note oppure uso il mutatiom scanning quando le mutazioni sono tanti e la probabilità di ciascuno è abbastanza scarsa Che permette una ricerca a tappeto del genio dei geni colpiti e correlate alla patologia 3)quando la mutazione non può essere caratterizzata ma si può seguire lo studio sul cromosoma che regala mutazione grazie alla famiglia che è ugualmente affetta con linkage o gene tracking CONFERMA DIAGNOSTICA DI UN SOSPETTO CLINICO Es: fibrosi cistica Ho piccole mutazioni puntiformi abbastanza frequenti e quindi posso prevedere un primo livello di analisi con l'analisi diretta di queste mutazioni più frequenti Se però non riesco a individuare la mutazione posso passare un secondo livello di analisi che sarebbe lo scanning del gene ho quindi una ricercata pedo della mutazione di tutto il gene Infine se due livelli di analisi non danno il risultato sperato si può ricorrere all'analisi di Grossi di arrangiamenti che si sono presenti in eterozigosi potrebbero sfuggire ai primi due tipi di analisi Una volta che ho trovato in una famiglia il malato quello che posso fare è un'identificazione nei portatori sani quindi tipitizzare con sanguigniè l'iter diagnostico prevede la ricerca delle mutazioni riscontrate nell'affetto la conoscenza delle mutazioni nella famiglia mi permette di fare anche un'indagine prenatale utilizzando i genitori e andando a ricercare due mutazioni note Posso anche andare a fare una tipizzazione del genotipo come indagine preconcezionale sempre andando a ricercare le mutazioni più frequenti e si riscontra una mutazione in uno dei due partner quello che si dovrebbe andare a fare un'indagine di secondo livello e terzo le analisi di genetica molecolare hanno le loro peculiarità rispetto ad altri le analisi biomediche perché innanzitutto i test genetici sono onerosi economicamente e deve esserci una discreta motivazione per poterli eseguire sono necessari dei controlli di qualità ancora più rispetto alle altre analisi biomediche Dovrebbe essere effettuata una corretta interpretazione dei risultati perché l'analisi potrebbe non essere conclusiva e i risultati dovrebbero essere interpretati Quando si stabilisce un iter diagnostico, un test per una determinata malattia genetica si deve tenere bene in mente che cosa si sta andando a fare Si deve identificarela correlazione tra alterazione genetica della patologia verificare l'accuratezza del test genetico quindi la sua validità analitica e la sua validità clinica e valutare l'utilità clinica e solo allora si può pensare di poter dare il via a questo test diagnostico lavoro relazioni giorni malattia si deve basare su una identificazione diretta del gene malattia della mutazione genica oppure a volte può basarsi su caratteristiche legati all'espressione genica o a studi di associazione

Nel senso che quello che può mancare un'associazione con dei determinati mutazioni e almeno il gene deve essere noto la validità una clinica è data dalla specificità e dalla sensibilità della metodica utilizzata la sensibilità analitica di test non è mai assoluta

Eterogeneità geneticala stessa malattia, stesso fenotipo può essere causata da mutazioni in geni diversi 17:15

dopo aver effettuato i test genetici disponibili quello che ne esce è che a Valle di questi testa ne possiamo avere un risultato negativo anche in un individuo che affetto dalla patologia è quello è un pazzo negativo e quindi quello che succede è che a causa dell' eterogeneità genetica una patologia con un'alta eterogeneità genetica e quindi con mutazioni in tanti geni diversi alcuni geni possono sfuggire alla mia analisi io avrò un numero maggiore di falsi negativi ciao mi va a diminuire la sensibilità clinica anche la penetranza ridotta riduce la validità clinica perché riduce il valore predittivo positivo la penetranza è un concetto che a che fare con la popolazione cioè significa che percentuale della popolazione manifesta quello fenotipo avendo quell'allele?? Quello che succede e che se la penetranza ridotta e non è completa significa che io ho degli individui che hanno la mutazioni o le mutazioni se si tratta di una malattia autosomica recessiva però non mostrano il fenotipo della patologia quindi hanno le mutazioni ma non sono affetti questo fa sì che praticamente quando vado a effettuare i test di diagnostica molecolare io ho falsi positivi PCR Il termociclatore non fa altro che cambiare molto rapidamente tra una temperatura ben precisa ed un'altra per fare a venire le tre fasi che compongono il singolo ciclo della PCR la PCR oggigiorno è indispensabile per le metodiche di diagnostica molecolare ed ha due funzioni principali una di queste è analitica nel senso che può identificare la presenza o l'assenza di determinati variazioni nel campione in esame e poi vivere una funzione di tipo preparativo perché il campione amplificato serve come bersaglio per l'applicazione di altri ulteriori tecniche (metodiche a valle) di biologia molecolare come tecniche basate sul ibridazioni oppure sequenziamento diretto se si pensa a un analisi di mutazioni note dopo la PCR si effettuerà un'analisi con enzimi di restrizione ecc... Così come anche per le sconosciute

L'allestimento della reazione di PCR Durante la fase di designing dei primer è opportuno andare a calcolare la temperatura di melting di oligonicluotote Per premere di lunghezza normali viene utilizzata la somma delle guaine e citosine moltiplicata per 4 e la somma delle adenine e delle Mine moltiplicata per due naturalmente calcolata la temperatura di melting dei primer va calcolata la temperatura di annealing che non sarà esattamente uguale ma in genere qualche grado sotto tra i 2 e 4 gradi al di sotto della temperatura di melting per favorire la pagamento Vedi teoria del 50% dell'annealimg dei Primers

E le regole dei Primers

il premier va disegnato un pochino fuori dall'esone in modo tale che può essere capaci di leggere bene tutto l'esone

MGCL2 Magnesio cloruro Molto importante scelta delle concentrazioni Anche se a volte sono standard e si aggirano su 1 millimolare ingrediente che è sempre necessario per l'attività della polimerasi, per il corretto appaiamento dei primer, per la specificità del prodotto di PCR perché ha un influenza sulla temperatura per cui il DNA stampo si denatura una concentrazione troppo alta per esempio altera la specificità del pagamento dei primer al DNA target In particolar modo sono utili gli ioni magnesio perché servono alla DNA polimerasi dato che si recano in prossimità del sito canali catalitico della DNA polimerasi e aiutano a stabilizzare l'interazione con il nucleotide trifosfato che deve essere inserito sotto forma di nucleotidi monofosfato Il cloruro magnesio a un influenza sulle modalità di' a pagamento dei due filamenti in particolar modo del primer con il semblato perché il magnesio interagiscono elettrostaticamente con i fosfati in particolar modo con gli ossigeni dei fosfati e così facendo praticamente gli ioni magnesio in parte mascherano le cariche negative dei fosfati è quello che succede e che i due filamenti sono soggetti a un minor rispingimento sono in grado di avvicinarsi di più e quindi di annilare in maniera più facile ma ovviamente nella PCR un annealing troppo facile non è troppo auspicabile 17:15

perché può significare un certo grado di a specificità Quindi la concentrazione di magnesio cloruro può influire sulla specificità è sulla resa della PCR se io ho problemi di specificità nella PCR io posso ottimizzarla andando a ridurre la concentrazione di magnesio cloruro Dntp Hanno una influenza sulla specificità Ci sono delle concentrazioni e standard che vanno da 20 a 200 micro molare perché concentrazioni troppo alte andrebbero ad inibire l'attività della taq polimerasi e questo è dovuto all'effetto che hanno i dntp sull'azione degli ioni magnesio nel senso che ideò ci nucleotidi trifosfati interagiscono con lo ione magnesio per cui mettere nella paletta di reazione un elevato numero di molecole di dntp equivale a sequestrare una parte di ioni magnesio quindi diciamo che tendenzialmente la concentrazione alta degli dntp equivale quasi a diminuire la concentrazione degli ioni magnesio cloruro e quindi tenderà a dare meno prodotto ma più specifico Ci sono delle regioni particolarmente ostiche da amplificare con la PCR perché per esempio anche in vivo quello che succede e che la DNA polimerasi ha bisogno di sintetizzare accuratamente e rapidamente il filamento di DNA ma certe regioni interferiscono con questa elongazione rapida e questi siti sono definiti come siti di pausa dov'è la DNA polimerasi cessa temporaneamente la elongazione e questi siti di pausa sono in concomitanza con delle regioni che formano delle strutture secondarie particolarmente forti cioè quello che succede e che c'è la forca di replicazione e quindi i due filamenti di DNA sono separati ma quello che succede e che sui due filamenti ci sono delle regioni creano delle strutture secondarie tra il filamento stesso ovviamente nella cella ci sono una serie di meccanismi per poter andare a superare questi tipi di problemi ma nella reazione in PCR questi tipi di problemi si ripresentano a scapito della DNA

polimerasi taq con la differenza che non ci sono meccanismi di riparo mancano gli stratagemmi molecolari che la natura ha messo in otto per la cellula Per cui questi siti di pausa creano delle Air PIN particolarmente stabili e la DNA taq polimerasi ha difficoltà ad amplificare X-FRAGILE nella maggioranza dei casi la sindrome della x-fragile è causata da un espansione di triplette di tri nucleotidi CGG nella 5' utr del gene fmr1 Questa regione ripetuta si trova in mezzo ancora in un'altra regione sufficientemente ricca di citosina e guanina e quindi è come quasi se fossi una CpG Island solo che non normalità questa non è me dilata infatti la malattia non è causa solo delle espansioni di tripletta ma anche della metilazione di questa regione e ad essere metjn

1)ncbi 2) scaricare gene alodob 3)vado su ucsc 4) vado su ucsc annotationes of refseq ren (nm_*and nr_*) primo link 5) va presa isoforma quella dove nome gene e’ in un rettangolo 6) mrna genomic allignments clicco su link 7) supponiamo che voglia disegnare dei primers per seq 8) copio 9) tolgo cifre con sostituisci, altro, speciali, qualisiasi cifra, sostituisco con niente cioe che non ci mette neanche spazio 10) tolgo spazi con sostituisci, clicclo solo una volta barra di spazio per creare spazio e sostituisco tutto con niente: ora file e’ sotto forma di fasta 11)togliere anche paragrafo con sotituisci, altro, speciali, segno paragrafo

12)scegliere posizione ragionevole per amplificare esone e quindi per disegnare primers Tipo 10 bp prima e dopop esone scelgo 20 bp per primers 13) controllare strutture secondarie dei primers Per prova intercorso: disegnare primers, calcolare tm contando numero c,g,a,t Scegliere 2 primers con tm differenza di 2 gradi tra loro Che finiscano con una g o una c

Utilizzo softwer oligoexplore 1.2 Clicco prima icona file con foglio di carta alto a sx Si apre nuova finestra Copio tutta seq di esone Compare grafico che dice tm Upper primer e’ in rosso Seleziono una base per esempiio g perche voglio che finisca con g il 5’-3’ Poi faccio stessa con lower Mi esce mio primers forward scelto annilata con altra molecola di primer per vedere quanti appaiamenti canonci forma Trattini sono leg che si formerebbero bene, trattini/puntini sono appaiamenti meno favorevoli Mi dice anche tm per cui 50% sono annilate

Poi giu esce il loop cioe strutture che una molecola di primer forma con se stessa Controllo tm ed energia libera che escono subito sotto

Sulla destra mi dice posizione 5’, tm , lunghezza primer Tm la calcola esattamente con regola 4(g+c)+2(a+t)

Conteggio di dove inizia e finisce esone con revisione, conteggio parole Torno su softwere explore e vado su 233, cerco dove sta base 233 e faccio 50 basi prima piu o meno Doo faccio copia per primer cliccando la casella dopo file , copy upper primer e li incollo su word e li copio, cerco con trova ed evidenzio Il secondo rimer lo devo rigirare perche sono tutti e due in 5’-3’...