Esame di Biochimica applicata- Conta cellulare e Camera di Burker PDF

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LEZIONE 3 BIOCHIMICA APPLICATA 09/10/18 CONTA CELLULARE Per staccare le cellule che crescono in adesione dalle piastre viene utilizzata una soluzione di tripsina ed EDTA. La tripsina è un enzima proteolitico che stacca i legami che si formano tra le proteine presenti sulla membrana plasmatica con le proteine che sono adese sulla piastra. È prodotta dal pancreas sotto forma di tripsinogeno inattivo, che viene quindi secreto nell'intestino tenue dove viene attivato e trasformato in tripsina per mezzo di un taglio proteolitico

operato dall'enzima enteropeptidasi. La tripsina risultante, con lo stesso meccanismo di taglio proteolitico, è in grado di attivare altre molecole di tripsinogeno. Questo meccanismo di attivazione è comune a molte serin proteasi, ed è utile a prevenire l'autodigestione nel pancreas. L’EDTA è un chelante del Ca2+ e del Mg2+, questi cationi, ma specialmente il calcio, sono indispensabili per le proteine di adesione, e quindi la tripsina e l'EDTA sono usati insieme. In questa procedura l’operatore stacca le cellule dalla piastra, le porta in soluzione e le riporta su altre piastre. Se si deve effettuare un esperimento non si può non conoscere quante cellule sono sulla piastra. Quindi si pone la necessità di contare le cellule. Le cellule possono essere contate in vario modo: un metodo semplice ed economico è l’uso dell’emocitometro o camera di Burker. La camera di Burker serve per determinare il numero di cellule per unità di volume di un liquido e le cellule sono visivamente contate per mezzo di un microscopio ottico . Essa è costituita da: una base di vetro, ai due lati è presente un vetro smerigliato in cui ci sono delle graffette che mantengono un vetrino portaoggetti all’interno del quale abbiamo due scanalature. All’interno di esse è presente un rialzo che contiene una minutissima griglia, più precisamente abbiamo una griglia nel riquadro superiore ed una nel riquadro inferiore. Una volta preparata la sospensione cellulare, si prende il vetrino portaoggetti, lo si appoggia nella parte centrale della camera di Burker e con delle pinzette andiamo a stingere il tutto in modo tale che il vetrino rimanga bloccato nella parte centrale. Le cellule in coltura vanno contate sia ogni volta che si dividono le colture, che per scopi che riguardano gli esperimenti. Il conteggio delle cellule viene fatto o manualmente al microscopio con un emocitometro oppure con sistemi automatizzati. Il sistema automatizzato COULTER ha il vantaggio di una alta velocità di conta e di una elevata accuratezza e precisione, ha però il grosso svantaggio che non discrimina ne' le cellule morte dalle vive, ne' diversi tipi cellulari tra di loro . Un emocitometro e' formato da uno speciale vetrino portaoggetti con opportuno coprioggetto, e la conta viene effettuata utilizzando un microscopio. Questo tipo di conteggio e’ ovviamente più faticoso e più lento, ma ci permette di osservare l'aspetto (e quindi lo stato) delle nostre cellule. L'accuratezza della conta ottenuta in questo modo e' più che sufficiente per quasi tutti gli scopi sperimentali. Per valutare la vitalità cellulare si usa di solito la colorazione con Trypan blu, che e' un colorante che e' escluso dalle cellule vitali infatti solo le cellule con la membrana plasmatica danneggiata (e quindi morte) risulteranno blu. Per avere un conteggio che sia rappresentativo del nostro campione e' ovviamente necessario partire da una sospensione cellulare omogenea. Per contare le cellule in sospensione e’ sufficiente risospenderle bene con una pipetta, dato che tendono comunque a sedimentare sul fondo della fiasca, e che spesso possono crescere formando degli aggregati. L'aspirazione e l'espulsione del liquido vanno fatti con molta delicatezza, senza fare schiuma, che e' indice di denaturazione delle proteine (del siero) e anche di lisi cellulare. Un piccolo volume della sospensione (circa 100 μl) viene prelavato con una pipetta sterile, e mescolato con un volume uguale di una soluzione di Trypan blu allo 0.5 %. Bisogna fare attenzione che i volumi di cellule e di trypan siano effettivamente uguali o per lo meno perfettamente noti, perché dobbiamo calcolare la concentrazione di cellule nella sospensione di partenza e dobbiamo conoscere l'esatta diluizione operata. Per contare le cellule adese bisogna staccarle dal fondo della fiasca (o del contenitore usato) in modo pero' da avere una sospensione rigorosamente

unicellulare. Questo viene fatto di solito utilizzando una soluzione di tripsina/EDTA. Questo procedimento viene detto tripsinizzazione della coltura. La tripsina è un enzima proteolitico che ha la funzione di digerire le proteine della matrice extracellulare che permettono l'attacco delle cellule al substrato. E' utilizzata di solito una soluzione madre 1:250, dicitura che indica una soluzione in cui, nelle condizioni in cui il test viene eseguito, 1 g di tripsina digerisce 250 g di substrato. Oltre alla tripsina, questa soluzione contiene di solito EDTA (acido etilendiaminotetraacetico) allo 0.02%. L'EDTA e' un chelante del Ca2+ e del Mg2+. Questi cationi, ma specialmente il calcio, sono indispensabili per le proteine di adesione, e quindi la tripsina e l'EDTA sono usati insieme. L'attività della tripsina e' inibita dal siero, che contiene degli inibitori della tripsina; nel caso si utilizzino terreni senza siero, e’ necessario ricorrere a soluzioni di inibitori, come ad esempio l’inibitore della tripsina estratto dalla soia. Vi sono casi dove l'utilizzo della tripsina per staccare le cellule non e' raccomandato: alcuni tipi di cellule difatti richiedono altri enzimi proteolitici, come ad esempio pronasi, dispasi o collagenasi. Tuttavia, al contrario della tripsina, non abbiamo inibitori nel siero per questi tipi di enzimi, per cui è necessario allontanarli dalla sospensione cellulare mediante centrifugazioni e lavaggi. Le cellule molto aderenti si staccano difficilmente o si staccano a grappoli con la classica soluzione di tripsina: in questi casi si possono utilizzare soluzioni contenenti citrato ed EDTA. Infine, dato che gli enzimi proteolitici possono digerire in parte anche le proteine di superficie, nel caso che siano proprio queste il nostro oggetto di studio, e’ preferibile staccare le cellule con mezzi meccanici, come gli “scraper” o i “rubber policemen” , che però non ci consentono di ottenere sospensioni monocellulari adatte alla conta o ad alcune applicazioni analitiche. In alternativa, si può tentare una tripsinizzazione a 4°C, dato che il freddo dovrebbe salvaguardare maggiormente l’integrità di membrana. Vi sono diversi modelli di emocitometri, tra i quali i più usati sono le camere di Burker. Sono costituiti da un portaoggetti sul quale sono incise tre profonde scanalature che dividono la parte centrale in due aree isolate che costituiscono le camere di conta. Su queste aree sono disegnate delle griglie, che delimiteranno le aree in cui contare le cellule. Sia nella Burker che nella Neubauer il vetrino coprioggetto, una volta posizionato correttamente, delimita uno spessore di 0.1 mm. Il vetrino coprioggetto viene montato prima di inserire il campione: se la camera e' senza morsetti di bloccaggio per essere sicuri che il coprioggetto sia perfettamente aderente si bagnano le due corsie laterali con pochi microlitri di acqua e si appoggia il coprioggetto premendo, se sono presenti i morsetti di bloccaggio essi si stringono in modo tale che il vetrino da orologio rimanga bloccato sulla parte centrale. A questo punto con una pipetta Pasteur si appoggia una goccia del campione sulla camera proprio contro il bordo del coprioggetto. La goccia viene risucchiata per capillarità nella camera, e l'eventuale eccesso cade nelle scanalature. E' importante evitare di sporcare il coprioggetto. Nella camera di Burker, la griglia delimita con 3 linee ravvicinate parallele un grande quadrato diviso in 9 quadrati ciascuno dei quali è diviso ulteriormente in 16 quadrati ancora più piccoli aventi una SUPERFICIE di 1/25 mm2. Nella griglia si vanno a formare altre figure geometriche come quadratini piccolissimi con una superficie di 1/400 mm2 e dei rettangoli piccoli di superficie 1/100 mm 2. Per la conta delle cellule, dei 16 quadratini in cui è diviso il quadrato principale bisogna considerare tutti i quadrati ad ESCLUSIONE di quelli che toccano la base inferiore e le tre linee laterali sulla parte destra. Per la conta delle cellule ci sono diversi metodi: 1) Si possono contare i quadrati situati sulle diagonali di ciascuna griglia minimizzando in questo modo eventuali disomogeneità di distribuzione delle cellule nella camera. Dopo di che si calcola: - NUMERO MEDIO DI CELLULE PER QUADRATO (ogni quadratino possiede una superficie di 1/25 mm2) - SI TIENE IN CONSIDERAZIONE IL FATTORE DI DILUIZIONE, ovvero quante volte le cellule sono state diluite ad esempio con il Trypan Blu - SI CONSIDERA IL FATTORE DI CONVERSIONE ovvero 104 (10.000) che rappresenta il volume della camera il Burker Questi 3 punti ci permettono di risalire al numero di cellule presenti nella camera di Burker. Se vogliamo sapere la quantità totale delle cellule presenti nella fiasca, bisogna moltiplicare per il VOLUME DELLA SOSPENSIONE CELLULARE. Ovviamente per la conta delle cellule bisogna munirsi di microscopio e per contare al microscopio è bene abituarsi a portare l'obiettivo (10 X) quasi a contatto con il vetrino guardando il tutto fino a trovare la griglia.

2) L’altro metodo è utilizzare questa formula (sempre escludendo le cellule che toccano il bordo inferiore e le tre linee laterali poste sulla destra):

Una volta contate le cellule devono essere seminate ad una densità che ne consenta la crescita ottimale. La densità di semina dipende dal tipo di cellula e dall’area superficiale della fiasca. E’ importante che, dopo la semina, le fiasche siano etichettate in maniera chiara indicando la data, il tipo di cellule e il numero delle volte che le cellule sono state utilizzate per generare le subcolture. La forma delle cellule può fornire indicazioni importanti per valutare le condizioni di crescita della coltura: - cellule tondeggianti o galleggianti in coltura non sono un buon segno e potrebbero indicare la sofferenza delle cellule in coltura o di cellule morte. - se il numero di cellule aumenta al di sopra della norma significa che la coltura sta invecchiando o sta diventando meno vitale

CINETICA DI CRESCITA DELLE CELLULE ANIMALI IN COLTURA Quando le cellule vengono mantenute in condizioni di coltura ottimali, seguono uno schema di crescita (pattern) caratteristico nel quale si distinguono diverse fasi: 

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La fase iniziale si chiama FASE LAG: si osserva un’attività cellulare elevata, in assenza di crescita evidente di cellule. La durata di questa fase dipende da vari fattori tra i quali la vitalità delle cellule, la densità alla quale sono state piastrate e la composizione del terreno FASE DI CRESCITA ESPONENZIALE, detta FASE LOG: essa è caratterizzata da elevata attività metabolica durante la quale il numero di cellule aumenta rapidamente FASE STAZIONARIA: in cui non si osserva un ulteriore incremento della crescita a causa dell’esaurimento di nutrienti nel terreno, dell’accumulo di prodotti di scarto del metabolismo oppure per la mancanza di spazio che serve per una crescita ulteriore. Se le cellule vengono lasciate in fase stazionaria, dopo un certo periodo di tempo inizieranno a morire dando luogo alla FASE DI DECLINO.

TERRENO DI CONGELAMENTO- CRIOCONSERVAZIONE DELLE CELLULE Se sulle le cellule non devono essere effettuati più esperimenti possono essere congelate in azoto liquido mediante un processo noto come CRIOCONSERVAZIONE. Questo metodo consente di avere sempre una certa quantità di cellule senza doverle necessariamente preparare ogni volta a partire dai tessuti. Tuttavia il congelamento può avere degli effetti letali sulle cellule, in quanto può portare alla formazione di cristalli di ghiaccio all’interno della membrana plasmatica delle cellule (costituita da proteine, fosfolipidi e colesterolo) fino a farle rompere. Per minimizzare questi rischi, prima del congelamento alle cellule si aggiunge un agente crioprotettivo ovvero il dimetilsolfossido (DMSO) che è un solvente organico in grado di abbassare il punto di congelamento ed evitare la formazione dei cristalli di ghiaccio, quindi ha la funzione di proteggere le membrane delle cellule. Quando si vogliono congelare le cellule bisogna preparare un terreno di congelamento in cui la concentrazione del siero è del 20% ed anche il DMSO è al 20%. Questo terreno così composto garantisce l’integrità della membrana ed impedisce che nella membrana plasmatica si vadano a formare dei cristalli di ghiaccio. L’azoto è il maggior gas presente nell’atmosfera. Alla pressione di 1 atm ha un punto di ebollizione di 77° Kelvin ed una temperatura di -196°. Quando aumentiamo la pressione questo gas diventa liquido. Il congelamento garantisce la conservazione delle cellule ma ha dei pericoli: l’ ustione in quanto le temperature sono molto basse e necrosi se i tessuti vengono a contatto con questo gas. Se la velocità di raffreddamento è troppo alta, si avrà la formazione di nuclei di cristallizzazione sia nella soluzione che all’interno della cellula. Il raffreddamento delle cellule deve essere lento in modo tale da evitare la formazione di ghiaccio. Protocollo: 

Con le cellule tripsinizzate (A causa dell’inibizione da contatto, in una coltura confluente, le moltiplicazioni cessano e si ha quindi un rallentamento del metabolismo, con conseguente accumulo di prodotti tossici. Per permettere alle cellule di continuare a crescere è, quindi, necessario procedere a periodici trapianti in terreni freschi. A tale scopo si utilizza un procedimento indicato come tripsinizzazione, che consente di staccare le cellule dal substrato al quale sono adese, risospenderle in soluzione e quindi, trapiantarle in mezzo fresco, ricco di tutti quei componenti necessari alle cellule per le

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loro attività metaboliche (vitamine, sali inorganici, proteine e costituenti sierici. La Tripsina è un enzima proteolitico, che digerisce il materiale glicoproteico presente sulla membrana cellulare, responsabile dell’adesione, senza distruggere o uccidere le cellule) e centrifugate procediamo alla risospensione in 1 ml di terreno fresco. Preleviamo l ‘ 1 ml di questa sospensione e lo trasferiamo in una vial con l’aggiunta del 10% di DMSO (dimetilsolfossido). La vial criogenica (porvetta in polipropilene che riesce a sopportare temperature molto basse) è riposta in appositi contenitori che servono a rendere graduale l’abbassamento di temperatura, e quindi messa , nel nostro caso, in congelatore a -80°C. Il periodo di conservazione delle cellule dipende dal grado di raffreddamento, ad esempio, nel caso dell’azoto liquido (-196°C) può durare anche per anni.

PROCEDURA DI SCONGELAMENTO Per poter utilizzare le cellule che sono state precedentemente congelate, bisogna:      

rimuovere le vial criogeniche dall’azoto liquido e porle in un bagnetto a 37°C per 1-2 min, fino allo scongelamento dei cristalli di ghiaccio. La sospensione di cellule scongelate può essere trasferita in un tubo da centrifuga, nel quale viene aggiunto del terreno fresco. La sospensione a questo punto può essere centrifugata a 1000 giri al minuto per 10 min. Il sunatante viene rimosso per eliminare il DMSO, utilizzato durante il processo di congelamento Le cellule vengono risospese in 1 cm3 di terreno fresco (assicurandosi che eventuali aggregati vengano ridotti a cellule singole o ad aggregati molto più piccoli, usando una pipetta pasteur) Le cellule possono venir pipettate in una fiasca, nella quale è stato precedentemente aggiunto del terreno fresco La fiasca viene posta nell’incubatore per colture cellulari e in questo modo le cellule vengono lasciate aderire e crescere

Per evitare la tossicità del DMSO ci sono due procedure: quando le cellule devono essere scongelate, devono essere scongelate in quantità maggiori. Le cellule, una volta poste nel terreno di coltura in un giro di 2/3 ore si attaccano alla piastra di Petri. Successivamente aggiungiamo poi del terreno fresco, ed in questo modo si allontana il DMSO.

DETERMINAZIONE DELLA VITALITA’ DELLE CELLULE Si tratta di un operazione estremamente importante, poiché la crescita e la sopravvivenza delle cellule può dipendere dalla densità alla quale sono state seminate. Il grado di vitalità delle cellule viene determinato discriminando le cellule vive dalle cellule morte mediante il metodo dell’esclusione del colorante. Le cellule vive non assorbono determinati

coloranti, che vengono invece rapidamente assunti dalle cellule morte. Uno dei coloranti più usanti in queste analisi è il BLU TRIPANO (trypan Blu).  

Le cellule in sospensione vengono incubate con il trypan blu alla concentrazione di 0,4%, quindi il campione viene posto in un emocitometro Avviene la conta nella camera di Burker, conteggiando separatamente le cellule vive 8che non assorbono il colore) dalle cellule morte (che assorbono il colore)

Come detto in precedenza, il numero totale delle cellule viene calcolato: NUMERO TOT DI CELLULE = numero di cellule contate

x fattore di conversione x fattore di diluizione

numero di quadranti contati mentre la % delle cellule vive viene calcolata nel seguente modo: % DI CELLULE VIVE= numero di cellule non colorate contate x 100 numero totale di cellule contate E’ importante ricordare che il blu tripano avendo un’elevata affinità per le proteine del siero, può originare un’elevata colorazione di fondo. Il campione di cellule da contare non dovrebbe quindi contenere siero, che può essere rimosso lavando le cellule con PBS prima della conta. Il PBS è il tampone fosfato salino, cioè una soluzione tampone contenente cloruro di sodio, fosfato di sodio e in alcuni casi può essere presente il cloruro di potassio. Il PBS aiuta a mantenere il pH costante, mentre la concentrazione di soli e l’osmolarità sono generalmente correlate con quelle del corpo umano (soluzione isotonica). Grazie alla sua isotonicità ed alla non tossicità sulle cellule viene utilizzato per diluizioni e per riportare a volume le colture cellulari.

CONTAMINAZIONE Quando una determinata linea cellulare non serve più per gli esperimenti, essa non viene più utilizzata e viene congelata perché tenerle in coltura comporta una spesa economica inoltre tenendo una linea cellulare per parecchio tempo in coltura possono avvenire delle mutazioni in maniera del tutto naturale e quindi è possibile che ci possono essere delle mutazioni sul DNA. Inoltre, tenendo sempre le cellule in coltura per molto tempo, può insorgere il rischio di contaminazione. E' essenziale essere in grado di riconoscere gli agenti di contaminazione - batteri, funghi, lieviti e micoplasmi. La contaminazione microbica è una contaminazione pericolosa ma facilmente evidenziabile (grazie al microscopio ottico) in quanto se c’è una contaminazione batterica, i batteri si duplicano velocemente e nel giro di 12 ore il terreno diventerà completamente giallo. La CROSS CONTAMINAZIONE permette di contaminare una linea cellulare con altre cellule. Ad esempio, in se in coltura sono presenti dei fibroblasti essi possono essere contaminati con cellule tumorali. Un’altra contaminazione che possiamo avere con le cellule, oltre alla cross contaminazione e alla contaminazione con microrganismi, è la contaminazione da micoplasmi. È una contaminazione molto fastidiosa perché i micoplasmi sono dei microrganismi che sono formati da una membrana all'interno della quale ci sono:  

ribosomi che permettono la traduzione delle proteine un singolo cromosoma che gli permette la duplicazione.

I micoplasmi rappresentano un grande gruppo di microrganismi caratterizzati tutti dalla mancanza di una parete cellulare rigida. La presenza dei micoplasmi è particolarmente fastidiosa perché sono organismi molto piccoli che si inseriscono all'interno delle colture cellulari e vanno a creare dei danni abbastanza seri, danni che vanno ad alterare il metabolismo cellulare, la sintesi proteica, la duplicazione delle cellule. Quindi, quando le nostre cellule sono contami...