Estudo Imunologia – Avaliação da Imunocompetência II e FACS - Semana 12 PDF

Preview

Summary

Download Estudo Imunologia – Avaliação da Imunocompetência II e FACS - Semana 12 PDF

Description

Estudo Imunologia – Avaliação da Imunocompetência II e FACS Hoje focaremos em deficiências celulares e humorais. Estudos de caso com descrição de uma relação de métodos, testes que são usados para avaliar a imunidade humoral e a celular. -> FACS é a Citometria de fluxo em fase sólida -> utilizado para imunofenotipagem, chegando ao fenótipo das células células do sistema imunológico São utilizados anticorpos específicos para marcadores de superfície acoplados com fluorocromos -> Alternativamente, moléculas citoplasmáticas podem ser marcadas pela permeabilização temporária das células -> Detecção de sinais de fluorescência -> Dispersão de luz – tamanho da célula (forward light – scattering) e granularidade (side light – scattering). * Esse método se baseia no conhecimento básico de marcadores de superfície – moléculas que são expressas na superfície das células do sistema imune e que são identidade dessas células, ou seja, expressas apenas por elas e que servem para identificar essa população celular. Por exemplo, a célula T helper, que também é chamada de TCD4, pois ela tem em sua superfície o marcador CD4, que é um marcador que identifica essa população celular, assim como a TCD8 tem a molécula de superfície CD8. Essas populações podem ser identificadas por essas moléculas que são seus marcadores celulares. Dentro da população TCD4, se for necessário identificar as subpopulações Th1, Th2 e Th17, existem marcadores específicos para isso, assim como se for necessário identificar uma B naive, um plasmócito, uma célula B de memória e etc, utilizam-se os marcadores. * Muitas vezes essas moléculas são de superfície, mas podem ser também citoplasmáticas. * escolher anticorpos com fluorocromos diferentes para o aparelho diferenciar as populações por intensidade de fluorescência – é uma das variáveis que o citometro de fluxo define -> são os sinais de fluorescência, mas também avalia a dispersão de luz, identificando seu tamanho e granularidade. -> Permite a identificação das células através de marcadores de superfície. -> O número de células com um conjunto especifico de características podem ser contadas -> Linhagem teciduais, estágios de maturação ou status de maturação das células -> Os níveis de expressão de várias moléculas sobre essas células podem ser mensurados * então a partir desse tipo de análise pode ser feito diagnóstico de imunodeficiências por diminuição ou ausência de determinada população. * não só as células, mas também o quanto que tem de determinado marcador em cada célula. -> Em determinado paciente ou situação temos diversas populações (uma situação pelo tratamento com drogas que alteram a diferenciação celular). Na imagem ao lado temos alguns tipos celulares, e quero identificar as células pelos seus marcadores que estão na membrana – para isso uso anticorpos específicos as estas moléculas com fluorocromos diferentes. Embaixo tem um capilar muito fino que permite a passagem de uma célula por vez, e um laser emitido identifica fluorescência, tamanho, granularidade – além de contar quantas células que possuem as mesmas características

E depois são gerados gráficos -> dot plot -> que analisa a fluorescência por exemplo, mas pode também analisar a fluorescência em relação ao tamanho e granularidade. * cada bolinha representada é a leitura de uma célula, ela foi lida e é então reportada no formato de dot plot – o aparelho faz a contagem das células e transforma em porcentagem. -> Exemplo numa imunodeficiência -> utilizou-se marcador CD3 para células T em geral e CD19 para células B em geral. * no geral, as células T, independente do estado de maturação -> possuem CD3 * enquanto que as B, independente de estarem ativadas ou não -> possuem CD19 Numa imunodeficiência pela ausência de células B -> ausência da marcação na Citometria sobre o marcador CD19. CASO 1: Paciente com pneumonia por três vezes e vários episódios de otite media. Déficit de IgG, IgM e IgA. Contagem de linfócitos T pelo método de FACS normal, mas linfócitos B indetectáveis. Diagnosticado com agamaglobulinemia ligada ao X, doença em que se tem o gene BTK mutado no braço longo do cromossomo X, que codifica uma tirosina quinase importante para a sobrevivência e diferenciação das células B naive e sobrevivência das B maduras. Assim, o paciente apresenta infecções de repetição por bactérias extracelulares (piogênicas).  É um caso clássico de imunodeficiência humoral, pois se trata de uma criança que vai bem até os 10 meses de idade e que passa a ter uma serie de infecções por bactérias extracelulares. Um teste importante é a dosagem de Ig, que nesse caso deu IgG baixa, IgA indetectável e IgM baixa. Como um outro sinal que deve ter sido observado é a ausência da tonsila, indicando que a imunidade humoral se deve a ausência de célula B, foi pedido também FACS para quantificar as células da população de linfócitos que, só pelo hemograma, não havia sido detectado nenhuma anormalidade. Com isso, fecha-se o diagnóstico de imunodeficiência ligada a X. Os sintomas de infecções por bactérias extracelulares podem indicar uma imunodeficiência tanto de anticorpos quanto de sistema complemento. Por isso, pedem-se exames para avaliar ambos (no caso da via do complemento, analisa-se pelos testes CH50 e APH50 e para anticorpos dosa-se Ig).  No caso das bactérias extracelulares, a opsonização é feita tanto pelos anticorpos quanto pelo complemento, pois ambos tem a mesma importância – retirando-se um ou outro haverá comprometimento do sistema imune.  Os linfonodos também não conterão células B, mas conterão uma porção de outras células. Além disso, clinicamente os linfonodos não devem ser palpáveis. 1) O paciente foi bem até os 10 meses de vida. Explique esse fato. Até os 10 meses de vida, o paciente ainda contava com imunização passiva vinda das IgG maternas. 2) Levando em consideração que as infecções recorrentes encontradas nessa imunodeficiência são quase exclusivamente por Streptococcus e Haemophilus, que são bactérias encapsuladas. Qual outro defeito genético no sistema imune poderia clinicamente mimetizar a agamaglobulinemia ligada ao X? Deficiência do sistema complemento, que seria a outra forma, além dos anticorpos, eficiente para destruição de bactérias encapsuladas (opsonização). 3) As crianças com agamaglobulinemia não apresentam tonsilas palatinas, o que caracteriza importante achado diagnostico desta doença. Explique esse fato. As tonsilas palatinas são mais de 90% constituídas por linfócitos B. Dessa forma, nessa imunodeficiência, as tonsilas não chegam nem a ser formadas.

CASO 2: Paciente com sinusites recorrentes, pneumonia fúngicas e neutropenia. Foi diagnosticado com Síndrome Hiper-IgM ligada ao X. Essa síndrome é uma deficiência de CD40L, o que prejudica a interação CD40-CD40L para ativação de células B e interfere na iniciação da resposta humoral que direciona para a troca de classes de Ig. Além disso, a ausência de CD40L também interfere na ativação e expansão clonal de células T. Pacientes com essa síndrome podem formar anticorpos IgM em resposta a antígenos T-independentes, mas não a antígenos T-dependentes.  Chama atenção clinicamente o histórico de infecções – por bactérias piogênicas e microorganismos oportunistas, o que é sinal de imunodeficiência celular. Se fosse só por oportunistas seria uma imunodeficiência celular que não atinge humoral. Quando há mistura com bactérias piogenicas, a imunodeficiência celular atinge a humoral. 1) Essa imunodeficiência é classificada como celular. Sendo assim, explique por que ela atinge a resposta imune humoral. É classificada como celular pelo fato de CD40L, que é a molécula em deficiência nesse caso, é expresso por células T e atinge a imunidade humoral pelo fato de as células B necessitarem da interação CD40-CD40L para serem ativadas e trocar de classe de Ig. 2) Os anticorpos IgG são mais importantes que os anticorpos IgM na proteção contra bactérias piogênicas. Essa afirmação está correta? Explique. As bactérias piogênicas são as encapsuladas, e, portanto, são eliminadas via opsonização (e posterior fagocitose) pelos anticorpos e proteinas do complemento. Os fagócitos possuem receptores para a porção Fc de IgG e não de IgM, de forma que a IgG seja mais importante na proteção contra essas bactérias, pois elas serão fagocitadas tanto pela opsonização por IgG quanto pela ativação do complemento pela via clássica. A opsonização por IgM possibilita apenas a ativação do complemento. 3) Justifique por que o paciente apresentava anticorpos contra antígenos A e B e não contra estreptolisina? Os antígenos A e B são carboidratos e, portanto, não requerem células T para ativar células B a produzir anticorpos específicos. Entretanto, a estreptolisina é proteica (T-dependente). O fato de um paciente desenvolver anticorpos contra antígenos T-independentes e não contra T-dependentes é forte indicativo de hiper-IgM e, por isso, deve-se testar anticorpos naturais quando o paciente é O, A ou B (em AB espera-se mesmo que não tenha anticorpos). Nesse caso não foi necessário testes para detecção de anticorpos de vacinas, pois o indivíduo tinha acabado de ter uma infecção por streptococcus beta hemolítico, e, portanto, deveria apresentar anticorpos contra a estreptolisina, uma enzima produzida por essas bactérias. Entretanto, o paciente não apresentava anticorpos contra estreptolisina, mas apresentava anti-A e anti-B (que são IgM – pelo fato de os antígenos serem carboidratos). Essa imunodeficiência é classificada como celular pois é uma deficiência de um receptor que se expressa na célula T. Mas como esse receptor é um dos sinais para ativação da célula B, se não ocorrer a interação a célula B não se ativa contra antígenos proteicos. Se a célula B não se ativa, não há plasmócitos e nem anticorpos. Além disso, a célula T não se ativa da forma como deveria pois não há interação das células apresentadoras de antígeno com células T. FACS é utilizado para confirmação de suspeita diagnostica -> as células B naive são as que possuem IgM e IgD de membrana e as células B de memória é que possuem IgG e IgA de membrana. Dessa forma, ao não se encontrar células B de memória no plasma do paciente, determina-se que as células B não estão sendo ativadas. Além disso, incubou-se as células T com CD40+fluorocromo solúvel – em situações normais, deveria haver a ligação de CD40 fluorescente com CD40L da célula T. Como não foram detectadas as células por FACS, determina-se a ausência de CD40L.

* infecções oportunistas -> deficiência celular * infecção por piogênicos -> deficiência humoral...