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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS QUÍMICO FARMACÉUTICO INDUSTRIAL DEPARTAMENTO DE FISIOLOGÍA FISIOLOGÍA CELULAR

Práctica 7. Modulación de una función celular por señales químicas Equipo: 1 Grupo: 4FM1

Galicia Ornelas Bryan Hernández Rosales Dennis Paulina Pavón Martínez Karla Angélica Pérez Elías Antonio Aldayr Rodríguez Delgado Jesús

PROFESORES: Jessica Paulina Campos Blázquez Ana Lilia Gutiérrez Lozano Sergio Roberto Zamudio Hernández

17/04/2019

Introducción Las células del cuerpo humano tienen una tarea muy importante: comunicarse entre ellas y que dicha comunicación incluya grandes cantidades de información; ésta información se encuentra en forma de señales químicas o eléctricas, que se producen en una célula y son detectadas por otra célula. Los dos tipos de señales que pueden producir y recibir las células son las eléctricas, que incluyen un cambio en el potencial de membrana para generar un potencial de acción (ocurre en células excitables como células nerviosas y musculares) y las señales químicas, que incorporan el ligando o señal, un receptor en la misma u otras células y el correspondiente cambio celular que ocurre en la célula con el receptor o célula blanco o diana (Silverthorn. 2014). Las señales eléctricas comparten a las uniones comunicantes, con las señales químicas, en la forma de transmitirse entre dos células adyacentes. Los potenciales de acción generados en una célula, se transmiten como potenciales electrotónicos entre la célula emisora y la receptora, a través de uniones comunicantes. Las señales químicas, tales como iones, aminoácidos, ATP, AMP cíclico o glucosa atraviesas por las uniones comunicantes. La comunicación yuxtácrina o dependiente de contacto ocurre cuando una molécula se expresa en la membrana plasmática de la célula emisora para unirse a un receptor de la célula receptora, ambos se expresan por el tiempo necesario para que ocurra un proceso celular y se degradan para terminarlo. De igual forma, una célula emisora sintetiza una molécula que liberará al medio extracelular para que, al estar expuesta a células cercanas a la célula emisora, o por el transporte de la molécula a través del torrente sanguíneo, la señal llegue a su receptor y desencadene una respuesta en la célula diana. Si la célula emisora, además de sintetizar la señal, posee un receptor para la misma, es una comunicación autócrina; si las células próximas a la célula emisora poseen receptores para la señal es una comunicación parácrina; pero si la señal debe viajar a torrente sanguíneo debido a que la célula diana (aquella con el receptor para la señal) se encuentra lejos de la célula emisora, se denomina comunicación endócrina (Silverthorn. 2014). Los estrógenos, como el estradiol, y la oxitocina, dos hormonas que fueron utilizadas en la práctica, llegan a las células blanco mediante comunicación endócrina. Las hormonas, al ser señales, pueden clasificarse también en dos grandes grupos, hidrofílicas, como la oxitocina, que son moléculas que pueden disolverse en agua, y por tanto transportarse por torrente sanguíneo, líquido intersticial y llegar a las células blanco para unirse a su receptor de membrana, pues suelen ser moléculas muy grandes y poseer cargas. Por otro lado, están las hormonas lipofílicas, tales como el estradiol, las cuales son sintetizadas a partir de colesterol en una célula emisora, que guardará las hormonas sintetizadas en vesículas hasta que reciba una señal que le diga las libere y viajarán ancladas a proteínas plasmáticas, hasta que se disocian de las proteínas, llegan a las células blanco y atraviesan la membrana plasmática por difusión simple, uniéndose a sus receptores citosólicos o nucleares (Hall, J. & Guyton, A. 2011).

Los estrógenos se producen en las glándulas suprarrenales y en los ovarios, y son contenidas ahí hasta que se necesitan y se liberan al torrente sanguíneo, el estrógeno más importante para las hembras de la mayoría de las especies es el estradiol, éste interactúa con sus receptores nucleares (receptores para estrógenos, ER) que se encuentran en el citosol de las células diana; éstas células diana son principalmente aquellas responsables del desarrollo de los caracteres sexuales secundarios en las hembras; los estrógenos son sintetizados a partir del colesterol sanguíneo, siendo así que las primeras moléculas sintetizadas son andrógenos y progesterona, pero con la enzima aromatasa, cuya actividad está regulada por la hormona folículo estimulante, todos los andrógenos son convertidos a estrógenos y así pueden cumplir su función (Hall, J. & Guyton, A. 2011). Los estrógenos tienen efecto sobre el peristaltismo de la musculatura del oviducto y el movimiento de las fimbrias, estimulan la proliferación de la mucosa uterina, transforma el epitelio cúbico a epitelio estratificado para hacer más resistente tanto a la vagina como al útero (Cuenca, M. 2006). Por otro lado, la oxitocina es una hormona hidrofílica compuesta por nueve aminoácidos en su estructura, existen receptores de oxitocina principalmente en células de músculo liso en útero, glándulas mamarias, cerebro, riñón, corazón y ovarios (López, C. 2014); una vez unida a sus receptores, desencadena por medio de una vía Gq cambios celulares para que pueda ejercer sus funciones, entre las que se encuentra la de contraer el músculo liso del útero y así causar contracciones en el mismo para llevar a cabo el trabajo de parto, estimula la síntesis de prostaglandinas E2 y F2ⲁ que favorecen a su vez la contracción uterina, por otra parte, se encuentra presente para a secreción de la leche de las glándulas mamarias: la succión del pezón por parte del lactante detona la liberación de oxitocina a torrente sanguíneo (Cuenca, M. 2006).

Figura 1. (Izquierda) Estructura del estradiol. (Derecha) Estructura de la oxitocina. En este experimento se trabajó con ratas prepúberes a las cuales se les administró, por un lado, aceite de maíz a una rata vía subdérmica cada tercer día, y a otra rata, estradiol 0.5mg/Kg vía subdérmica, cada tercer día. Posteriormente se diseccionaron los cuernos uterinos de cada una para trabajar con ellos. Las ratas poseen un útero bicorne que está localizado en la cavidad abdominal en la parte posterior al intestino grueso, cada cuerno uterino tiene una longitud aproximada de 3 cm y se une cada uno a un canal vaginal individual. Los cuernos uterinos

propiamente están formados por tres capas de tejidos, epimetrio, la capa que lo recubre; miometrio, la capa de músculo liso que se halla en forma transversal como longitudinal y el endometrio, que es la capa glandular que recubre hacia la luz del cuerno uterino. El músculo liso uterino son células fusiformes con un núcleo único y central, presenta varias mitocondrias y escasas miofibrillas, se encuentra dispuesto tanto de manera transversal o rodeando al útero en su circunferencia, y de manera longitudinal o rodeando al útero a lo largo del mismo; esta disposición permite que las contracciones involuntarias que poseen las células se realicen en todas direcciones, para facilitar el parto.

Figura 2. Corte transversal de cuerno uterino de rata. Objetivos -Determinar los porcentajes de fuerza y duración de las contracciones de cuerno uterino de rata prepúber tratado con concentraciones crecientes de oxitocina. -Determinar el efecto de la oxitocina en concentraciones crecientes, sobre la contractilidad de los cuernos uterinos de ratas prepúberes administradas con estradiol 0.5mg/Kg y otras, administradas con aceite de maíz. Fundamento La cuantificación de la contractilidad se realizó usando un transductor de fuerza conectado al equipo MP36 de Biopac que, atado al órgano depositado en una cámara de órgano aislado con solución de García de Jalón, fue sometido a diferentes concentraciones de oxitocina provocando las contracciones en el músculo liso del cuello uterino de rata, mediante el muestreo en lapsos de 5-10 minutos y a través del tratamiento estadístico se determinan y representan gráficamente las dependencias del porcentaje de fuerza de contracción y la duración de las concentraciones respecto al tiempo. Se utilizaron ratas hembras prepúberes ya que sus órganos sexuales aún no están completamente desarrollados, por lo tanto, la concentración de estradiol es baja pues la producción de estrógenos no está establecida del todo, por lo que se

podrá evaluar los efectos del estradiol administrado. Asimismo, se descartó el uso de analgésicos para su sacrificio, ya que estos son neurodepresores y producen un efecto negativo en la contractibilidad de las células excitables. El estradiol es una molécula señal o primer mensajero capaz de atravesar la membrana plasmática de las células cuyos sus receptores se encuentran en el citosol y en el núcleo celular. La administración del estradiol se realizó una semana antes pues el proceso después de unirse con sus receptores nucleares (α y β) para la transcripción de genes, requiere de varios días para llevarse a cabo. Éste proceso es necesario para el aumento de síntesis de proteínas, el cual propicia una mayor expresión de receptores para oxitocina, aumento en cantidad de grasa y aumento en la vascularización. Las cantidades de estradiol que se administraron fueron suficientes para asegurarnos que su efecto se lleve a cabo. Por otro lado, al ser la oxitocina un péptido, no puede atravesar la membrana celular, por lo que, sus receptores se encuentran en la superficie celular, ésta promueve la contracción uterina cuando llega a sus receptores por vía endócrina, el colocarla sobre la solución de García de Jalón, se simuló este hecho fisiológico en el experimento. La solución García de Jalón es hipocálcica y fisiológica, es decir, es un medio iónico y enérgico, con presencia de glucosa; con estas características asemeja el medio donde se encuentra el útero. La temperatura de esta solución (28.5°C durante el experimento), al igual que la característica hipocálcica, son con el fin de evitar contracciones espontáneas. El cuerno uterino se colocó en una cámara de órgano aislado con aireación constante pues es importante porque permite que el músculo pueda producir ATP y se pueda llevar a cabo el proceso de contracción.

Metodología

Resultados

Figura 3. Contracciones uterinas inducidas por 50nM de oxitocina, en cuerno uterino de rata tratada con aceite de maíz. 1.24g, 1.26min, 4ondas/5min.

T-50nM

C-100nM

T-100nM

C-200nM

T-200nM

C-500nM

T-500nM

Discusión Al llevarse a cabo el experimento, se sabía con antelación que la presencia de estrógenos impulsaría la expresión de receptores para oxitocina en las células de músculo liso en el cuerno uterino de las ratas, y esto llevaría a una mejor y mayor contracción del cuerno uterino. Para poder demostrarlo se utilizaron dos cuernos uterinos, uno de una rata tratada con aceite de maíz la cual será la rata control, y otro cuerno uterino de una rata tratada con estradiol 0.5mg/Kg durante una semana. El hecho de haber administrado a las ratas con una semana de anticipación fue con el propósito de que para el día del experimento, todas hubiesen sintetizado proteínas relacionadas a los receptores para oxitocina, para que además de ello, se mostrara alrededor de los cuernos uterinos una mayor vascularización. Como se muestra en la figura 3, durante el periodo basal se observó únicamente una contracción de corta duración y fuerza, la cual fue restada a todos los valores posteriores; una vez que se administró oxitocina 50nM las contracciones observadas fueron más duraderas que la primera, pero al ser de la rata control se esperaba que no hubiese mucha diferencia, justo como se puede ver en la imagen; por otro lado, la imagen 4 muestra el fragmento basal de la rata tratada donde no hubo contracciones involuntarias, y una vez que se añadió la oxitocina 50nM, las contracciones fueron de corta duración y amplitud, pero esto puede deberse a que

no hay mucha disponibilidad de oxitocina para que se saturen todos los receptores a la misma, y por ello las contracciones son pequeñas. Por otro lado, las figuras 5 y 6 muestran las contracciones de la rata control y tratada, respectivamente, con oxitocina 100nM; las ratas control mostraron un aumento en la frecuencia de las concentraciones pero la duración de las mismas parece mantenerse constante, siendo que así, no importa que haya aumentado la concentración de oxitocina, la respuesta uterina continúa constante. Pero se observa que la rata tratada muestra un aumento no muy notorio en la frecuencia ni en la fuerza, pero si es algo notorio en la duración de las contracciones, asimismo, no existe mucho tiempo de recuperación entre una concentración y otra, por el aumento de la oxitocina y que así, se activen más receptores; al activarse y llevar a cabo una vía Gq, lo que permiten es que a partir de la activación de la proteín cinasa C (PKC) y la liberación de calcio, permiten que se contraiga el músculo liso del cuerno uterino. Al aumentar a 200nM la concentración de oxitocina, se ve en la copla de figuras 7 y 8 que la rata control aumentó la frecuencia de las contracciones y se redujo el tiempo entre ellas, así como tampoco se estabiliza por completo después de cada contracción; a diferencia del cuerno uterino de la rata tratada, el cual mantuvo su frecuencia, la fuerza de las contracciones aumentó, se observa menos tiempo de separación entre cada contracción y la duración de cada una disminuye. Estos cambios en ambas ratas ocurren por la disponibilidad de los receptores a oxitocina, pues comienzan a saturarse, a tener mucha concentración extracelular del ligando y así generan que la respuesta celular sea mayor, es decir, aumente la contractilidad del cuerno uterino. Finalmente, se puede ver que la figura 9 y 10 poseen la mayor concentración de oxitocina utilizada, 500nM; en la rata control se observa que la frecuencia de las contracciones ha aumentado, disminuye el tiempo entre ellas pero aumenta la duración de cada una, así como la fuerza que ejerce por contracción, sin embargo, no es mayor que la generada con la concentración de 100nM, muy probablemente porque ahí se encuentra la concentración óptima de oxitocina extracelular para la contracción en ratas administradas con aceite de maíz, pero se debe recalcar que, debido a que no se realizaron lavados del cuerno uterino, la concentración real que tenía en ese momento el cuerno uterino era de 150nM. Por otro lado, se observa que el cuerno de la rata tratada con estradiol tuvo una mayor duración en las contracciones que generó, así como la mayor fuerza observada únicamente con el cuerno uterino de rata tratada con estradiol, siendo que, de ésta manera, a mayor concentración de oxitocina extracelular, más oxitocina se une a sus receptores y genera mayor respuesta celular. Las gráficas fueron elaboradas con el porcentaje de fuerza y duración, donde el 100% fue tomado por el valor más grande encontrado en ambos experimentos para comparar, es decir, el valor mayor tanto del cuerno tratado como el no tratado con estradiol, y ambos valores (de fuerza y duración) fueron hallados en el cuerno uterino no tratado, es decir, a la rata se le administró aceite de maíz solo. Como se mencionó, la mayor fuerza que se logró en el cuerno uterino no tratado se alcanzó a

los 150nM, por lo que ese punto fue el 100% y se observa que no se ajusta a la recta en la figura 11, pero el resto de los puntos se mantienen casi constantes, siendo que la fuerza no varía mucho a pesar del cambio en las concentraciones de oxitocina; cosa que no ocurre con la rata tratada con estradiol, pues se observa una tendencia ligeramente sigmoide donde a mayor concentración de oxitocina, mayor es la fuerza que se genera en esa contracción, siendo que, de esta forma, el cuerno uterino tratado tiene una mayor contracción cuando la concentración de oxitocina es de 500nM. La duración de las contracciones no varió demasiado en ninguno de los dos cuernos uterinos, pero hubo una mayor duración, nuevamente, en el cuerno uterino de la rata control, a una concentración de oxitocina de 850nM, pues justo cuando inició la administración se generó una contracción con una amplia duración; se observa que conforme aumenta la concentración, aumenta la duración y amplitud de las mismas, pero los valores no tienen una gran variación entre ellos, como se puede ver en la figura 12. La duración de las contracciones se mantuvo en valores cercanos al minuto, pero conforme se iba aumentando la concentración de oxitocina, los cuernos uterinos no alcanzaban a relajarse totalmente entre contracción y contracción, lo que alteró el patrón de duración de las contracciones. Conclusiones La fuerza de las contracciones incrementa en las ratas tratadas con estradiol conforme se aumenta la concentración de oxitocina administrada, sin embargo en la rata control se presenta una fuerza máxima en una concentración 150 nM. La duración de las contracciones en ratas tratadas con estradiol al aplicar oxitocina, disminuye al aumentar la concentración administrada,en donde al acercarse al 18% en una concentración de 850 mM, se presentó la duración máxima en la rata control, donde la duración tuvo pocas desviaciones. Una mala conservación del útero durante la experimentación pudo haber ocasionado la muerte de las células que conforman el tejido, por lo cual se presentaron desviaciones con respecto al comportamiento esperado. Referencias Cuenca, M. (2006). Fundamentos de fisiología. Madrid. España: Editorial Paraninfo. Figueroa, H., Marusic, E., H. Gonzales, M., Barcos, F. & Yungue, P.. (2002). EFECTO IN VITRO DE LA INSULINA SOBRE LA CAPACIDAD CONTRACTIL UTERINA INDUCIDA POR OXITOCINA. Abril 11, 2019, de Revista chilena de obstetricia y ginecología Sitio web: https://scielo.conicyt.cl/scielo.php? script=sci_arttext&pid=S0717-75262002000300003 Hall, J. & Guyton, A. (2011). Fisiología Médica. Barcelona, España: Elsevier España, S.L. IPN. ENCB. (2018). Manual de laboratorio de fisiología celular (QFI). 3 a edición. México. Levy, M. (2009) Fisiología. 6ª edición. Editorial Elsevier. Madrid. López, C. (2014). Oxitocina, la hormona que todos utilizan y que pocos conocen.

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