Extracción De ADN Genómico De La Escherichia coli PDF

Preview

Summary

Facultad de Ciencias Programa de De ADN De Escherichia coli Paula A. De Alba1, Cindy P. A. Rojas1 1 Estudiantes del Programa de Facultad de Ciencias Universidad del Km 7 Antigua Puerto Colombia Resumen: Esta fue realizada con el objetivo principal de familiarizarse con utilizadas para la de ADN en e...

Description

Facultad de Ciencias Básicas Programa de Biología

Extracción De ADN Genómico De Escherichia coli Paula A. De Alba1, Cindy P. López1 & René A. Rojas1 1

Estudiantes del Programa de Biología, Facultad de Ciencias Básicas, Universidad del Atlántico Km 7 Antigua vía Puerto Colombia

Resumen: Esta práctica fue realizada con el objetivo principal de familiarizarse con metodologías utilizadas para la extracción de ADN genómico, en este caso de bacterias. Se utilizó un cultivo de bacterias de E.Coli (Escherichia coli) y un conjunto pasos los cuales consistían en primer lugar realizar la lisis celular con ayuda de un amortiguador de lisis, en segundo lugar la extracción con NaCl y Cloroformo que tiene como función separar la solución de las proteínas insolubles en agua; como tercer paso la deshidratación la cual fue hecha con alcohol para conseguir que el ADN fuese soluble en agua y cuando se precipite sea sólido, la elución donde el ADN se hizo soluble nuevamente en una solución agregando agua donde sólo debería haber ADN y por último la verificación que se obtuvo por medio de la electroforesis en gel donde se encontró que el ADN extraído del cultivo estaba contaminado por proteínas Palabras claves: E.Coli, extracción.

Introducción Desde 1869 en suiza donde Friedrich Miescher realizo la primera extracción de ADN, se desencadenaron una cascada de eventos donde la genética se veía involucrada. Gracias a esta la biología molecular, la medicina tuvieron grandes avances. La extracción de ADN genómico tiene más importancia de la se podría imaginar, gracias a esta se han descubierto enfermedades como el cáncer, la diabetes, existen productos para la piel, se pueden realizar pruebas de sangre, de parentesco y se han encontrado la cura a muchas enfermedades. 1

Para obtener una extracción de ADN correcta se debe tener en cuenta una serie de detalles como saber de qué tiempo es la

célula que se va a tratar, si el ADN proviene de una célula eucariota o procariota por la razón de que existen diversos mecanismos de extracción genómica para cada tipo de célula los cuales incluyen tratamientos físicos, químicos y enzimáticos o la unión de estos. Los cuales como primer objetivo deben promover a una lisis celular efectiva. Metodología Protocolo genómico.

de

extracción

de

DNA

1. Se tomó un microtubo y se rotuló, con ayuda de una micropipeta se tomaron 1500µl (1,5 ml) del cultivo de bacterias E. coli. Se sometió a

7

2.

3. 4.

5.

6.

7.

centrifugación en una centrífuga durante 5 minutos a 13.000 rpm. Pasados los 5 minutos se retiró la muestra y se descartó el sobrenadante depositándolo en un recipiente con hipoclorito y tomando el precipitado. Se tomó el mismo microtubo con el precipitado y se le agregó 200µl de amortiguador de lisis, se sometió a rozamiento contra la mano con el guante hasta que la muestra resuspendió. Luego de esto se le agregaron 100µl (5 M) de NaCl (Cloruro de Sodio). Se sometió a centrifugación nuevamente durante 10 minutos a 13.000 rpm, pasado esto se extrajo el sobrenadante a otro microtubo nuevo. con ayuda de una micropipeta teniendo en cuenta la cantidad de sobrenadante total que fue, esta misma cantidad será agregada, pero de cloroformo alcohol isoamílico. En nuestro caso 330 µl y se mezcló invirtiéndolo. Se centrifugó durante 3 minutos a 13000 rpm se transfirió el sobrenadante a un tubo nuevo (tubo3). Obteniendo 200 µl de sobrenadante. Se agregaron 2 volumen de Etanol al microtubo, es decir 400 µl (Etanol frío 0.6) y se procedió a mantener refrigerado durante 15min a una temperatura de 11,4 °C. Para

Facultad de Ciencias Básicas próximamente someterlo a centrifugar Programa de Biología a 13000 rpm durante 10 min. 8. Se descartó el sobrenadante, se agregaron 500 µl de Etanol al 70% para lavar el ADN y centrifugar a 13000 rpm. 9. Nuevamente se descartó el sobrenadante, se centrifugó a 13000 rpm durante 10min, se volvió a descartar el sobrenadante para sólo encontrar el ADN, se agregaron 20 µl de agua y vertex por varios segundos. 10.Se preparó el Buffer al cual se le agregó Bromuro de Tidio. 11. Para el gel en total se trabajaron 10 µl de solución, de la cual 3 µl corresponden al buffer de carga (azul de glicerol) y 7 µl a la muestra de ADN.

Resultados y Discusión. Con la metodología aplicada anteriormente se logró obtener cierta cantidad de concentración de ADN en la mayoría de muestras estudiadas (G1, G2, G3, G4, G5) excepto en N, donde la muestra con más ADN fue G2 y con la menor cantidad fue G5. Respecto a las muestras donde hay contaminación de proteínas y lípidos (G1, G2, G3 y G4) se debe a errores en la fase extracción, cuando fue agregado el cloroformo y NaCl y luego centrifugado, esto fue utilizado con la finalidad de aumentar la fuerza cónica de la solución para separar lo soluble (ADN) y lo insoluble (lípidos y proteínas) haciendo que las proteínas se

7

precipiten, las moléculas antipáticas en la mitad y el ADN en la superficie. Lo más probable es que haya existido un error cuando se intentó revolver la muestra con el NaCl y el cloroformo antes de colocarla en la centrifuga y como resultado, el ADN está contaminado o errores al pipetear tratando de extraer el sobrenadante resultado de la centrifuga (ADN). En los grupos (N y G5) donde no se encontró ADN en (N) y no el suficiente en (G5) se pudo haber cometido un error cuando fue agregado el amortiguador de lisis y este se sometió a rozamiento con la mano para disolverlo en la muestra. El amortiguador de lisis contenía (TRIS + EDTA + SDS) Donde EDTA (Regulador de pH y acetato de sodio) es quien captura los iones divalentes Mg, Mn para que las DNAsas no rompan el ADN. Si este no fue disuelto lo suficiente no se produce una correcta lisis celular dando como resultado la extracción poca o nula del ADN.

Facultad de Ciencias Básicas de los pocillos, reflejando que en el carril 3 Programa de Biología hay un buen resultado.

Conclusion Para la extracción de ADN se debe llevar con rigurosidad cada paso de este proceso, por la complejidad que este presenta; si se daña en su totalidad la muestra los pasos a realizar nuevamente para la desinfección de esta se harán mucho más complejas. Con el resultado obtenido, se refleja la inexperiencia y el poco cuidado que se realizó en este proceso, ya que la muestra resulto contaminada, pudiendo ser por errores de mediciones, reactivos o quizás humanos durante el proceso. Como consecuencia grupos donde se encontró una buena cantidad de ADN contaminado con proteínas, otros donde no había y otros donde había más proteínas y lípidos que ADN. Bibliografía 1.Ecología molecular. Instituto Nacional de Ecología, 2007. Pag (599-513) Puerta, C. J., & Ureña, C. P. (2005). Prácticas de biología molecular. Pontificia Universidad Javeriana. Pag (1532).

Figura 1. Fotografía del gel en luz UV. El gel utilizado fue agarosa para visualizar la integridad del ADN de E. coli en cada uno

Castro, J. E. Z. (2005). Manual de técnicas básicas de biología molecular (Vol. 7). UADY Pag (37-39)

7

Facultad de Ciencias Básicas Programa de Biología

ANEXOS Artículo 1. 1. En tubos de 30 mL se colocaron 0,5 g del tejido macerado (tejido foliar joven libre de enfermedades de dos especies de orquídeas: Cattleya violácea y Cattleya mossiae pulverizado con nitrógeno líquido) y se agregó 5 mL del tampón de extracción (100 mM Tris-HCl pH 8.0; 1,4M NaCl; 20 mM EDTA; 2 % CTAB, 1 % polietileno-glicol y 0,5 % de sulfito de sodio), precalentado a 74 ºC. Se aplicó vortex por 3 segundos (en el protocolo original se utilizan 75 ºC para el precalentamiento e incubación). 2. Los tubos fueron incubados a 74 ºC durante 20 min, se les aplicó vortex por 10 segundos y se dejaron enfriar a temperatura ambiente. 3. Se agregaron 5 mL de cloroformo: alcohol isoamílico (24:1) a cada tubo y se agitaron por inversión unas 50 veces, para ser centrifugados a 10.000 rpm durante 15 min.

A continuación se mencionan los siguientes pasos, los cuales constituyen modificaciones al protocolo de Risterucci (2000) realizadas en este experimento: 1. Al pelet resuspendido se le agregaron 500 µL de TE 1X y 50 µL de acetato de sodio 3M pH 5,2; para mezclar por inversión de los tubos. 2. Se agregaron 500 µL de isopropanol frío, mezclando por inversión los tubos y colocándolos sobre hielo durante 20 min. Los tubos fueron centrifugados a 14.000 rpm por 10 minutos, el sobrenadante descartado y el pelet se lavó dos veces con 500 µL de etanol 70%. 3. El etanol fue descartado y se dejó secar el tubo a temperatura ambiente. 4. Se agregaron 100-500µL TE 1X para resuspender el ADN. Artículo 2.

4. El sobrenadante se transfirió a un tubo nuevo con 5mL de isopropanol frío, agitando suavemente hasta observar la formación del pelet de ADN. 5. Los tubos fueron colocados un mínimo de 2 horas a -20 ºC. Con la ayuda de una pipeta Pasteur moldeada se transfirió el pelet a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL y se resuspendió entre 500 a 1.000 µL de TE (50 mM Tris-HCl, 0,7 M NaCl 10 mM EDTA).

1. Para la obtención del tejido de oreja de los ratones y ratas (Rattus norvergicus), se realizó la limpieza y esterilización del material de trabajo, se limpió cada oreja de los ratones y ratas a usar, con alcohol al 70% para desinfectar y evitar contaminaciones futuras. 2. Se tomaron fragmentos de la oreja, de -2x2 mm2, de 10 ratones y de 80 ratas (40 machos y 40 hembras), en tubos eppendorf estériles com 500 IJL de la solución 1 (Buffer TE; NaCI 0,4 M)

7

pH 8,2. 3. La solución de lavado fue descartada, adicionando posteriormente 400 IJL de solución 1,más 40 IJL de SDS (Sigma) al 10% Y 8 IJL de Bromelina 20 mg/mL). 4. Las muestras fueron incubadas en estufa a 3rC durante 2 horas, transcurrido este periodo de tiempo la temperatura de la estufa fue aumentada, a 65°C por 15 minutos más, con la finalidad de inactivar la enzima. 5. Luego se agregaron 300 IJL de NaCI a 6M, agitando seguidamente por inversión hasta observar la homogenización de la solución. 6. Las muestras fueron centrifugadas en frío durante 30 minutos a 12.000g en centrifuga.

Facultad de Ciencias Básicas estufa a 3rC, resuspendido y almacenado Programa de Biología en 100 IJL de agua. ultrapura.

11. Para la estimación de la concentración del ADN genómico obtenido se realizó una dilución del ADN en agua, para posteriormente realizar las medidas de absorbancia a 260 y 280 nm, en un espectrofotómetro. La integridad del ADN se evaluó mediante electroforesis en geles de agarosa; para ello se prepararon geles de agarosa al 0,9% en buffer TBE 0,5X, pH 8,2 empleándose como marcador de peso molecular A Hind 111 (Invitrogen) y revelado con bromuro de etidio (PROMEGA). La electroforesis en agarosa fue realizada a 90 Voltios durante 60 minutos y las bandas fueron visualizadas en un transiluminador UV de 254 nm.

7. El sobrenadante se transfirió a tubos nuevos y estériles adicionando 1 volumen de isopropanol (Merck), mezclando por inversión. Las muestras se dejaron durante 12-18 horas a 4oC en uma nevera convencional de 287 L. 8. Transcurrido este tiempo, las muestras se centrifugaron a 12.000g en frío por 30 minutos. 9. Finalmente, el precipitado fue recuperado y resuspendido en 100 IJL de agua ultrapura. Las muestras de ADN se reprecipitaron, adicionándole 50 IJL de NaCI a 0,3M y 2,5 volúmenes de etanol absoluto, se dejaron a -20°C (congelador), durante 12 horas. 10. Seguidamente se centrifugó por 10 minutos a 12.000g, y se lavó el precipitado con 1 mL de etanol 70% frío, secado en

7

PROTOCOLOS Facultad de Ciencias Básicas Programa de Biología

SIMILITUDES

DIFERENCIAS

1. Se aseguraron que los tejidos estén libres de enfermedades y contaminación. 2. Primeramente se les aplica un Buffer o tampón para pasar a hacer vortex y/o lavada. 3. Para ambos protocolos se usó el Etanol al 70% frío para lavar los precipitados. 4. El resultado en ambos procesos fue satisfactorio. Aunque tenían diferencias, para ambos hubo obtención de ADN.

1. En el protocolo #2 utilizan SDS para la separación de las proteínas. En el protocolo #1 utilizan cloroformo. 2. Las muestras fueron incubadas de distinta manera en el protocolo #1 es en frío (-20°C) mientras que en el #2, es en calor (65°C) por primera vez. 3. En muestras de animales hubo más proceso, hablando de centrifugaciones, transferencia de sobrenadantes, etc. 4. Después del lavado con el etanol al 70%, en el protocolo #1 se dejó secar a temperatura ambiente y en el #2 fue secado en estufa....