Informe 5. Análisis del metabolismo de Escherichia coli y Pseudomona aeruginosa PDF

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Informe de laboratorio del curso fisiología microbiana...

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ANALISIS DEL METABOLISMO DE Escherichia coli Y Pseudomona aeruginosa A DIEFERENTES CONDICIONES DE OXIGENO Y ACEPTOR DE ELECTRONES EN MEDIO O/F

RESULTADOS CRUDOS Prueba de desnitrificación Zinc Desnitrificación

Nit Medio de Condición cultivo Microorganismo Aerobia E.coli Am/Am O/F Glucosa P.aeruginosa Am/V O/F Glucosa + E.coli Am/Az KNO 3 P.aeruginosa V/Az E.coli Am/Am O/F Lactosa P.aeruginosa V/V O/F Lactosa + E.coli Am/v KNO 3 P.aeruginosa Az/Az

Condición Aaerobio Anaerobio Anaerobia Am/Am NA NA V/V Am/Az (+) (-) Az/Az NA NA Am/Am NA NA V/V Az/Az (+) NA Az/Az NA NA

Presencia de Gas

Aaerobio

Anaerobio

NA

NA

NA

NA

NA NA

(-) NA

NA NA

(+) NA

NA

NA

NA

NA

NA

NA

NA

NA

Aerobio

Anaerobio

Aaerobio

No No No No No No No No

Anaerobio

No No No Si Si No No No

Tabla 1. Resultados de prueba O/F y desnitrificación para Escherichia coli y Pseudomonas aeruginosa

RESULTADO PROCESADO

Condición de oxigeno

Aerobio

Anaerobio

Escherichia coli Glucosa

Glucosa + KNO3

Lactosa

Lactosa + KNO3

Respiración aerobia/ Fermentación

Respiración aerobia/ Respiración anaerobia

Respiración aerobia/ Fermentación

Respiración aerobia/ No crecimiento

Fermentación/ Fermentación

Respiración anaerobia/ Respiración anaerobia

Fermentación/ Fermentación

Respiración anaerobia/ Respiración anaerobia

Tabla 2. Metabolismos realizados por Escherichia coli a diferentes condiciones de fuente de carbono y aceptor final de electrones.

Condición de oxigeno

Pseudomonas aeruginosa Glucosa

Glucosa + KNO3

Lactosa

Lactosa + KNO3

Aerobio

Respiración aerobia/ No crecimiento

No crecimiento/ Respiración anaerobia

No crecimiento/ No crecimiento

Respiración aerobia/ Respiración anaerobia

Anaerobio

No crecimiento/ No crecimiento

Respiración anaerobia/ Respiración anaerobia

No crecimiento/ No crecimiento

Respiración anaerobia/ Respiración anaerobia

Tabla 3. Metabolismos realizados por Pseudomonas aeruginosa a diferentes condiciones de fuente de carbono y aceptor final de electrones.

ANÁLISIS Las bacterias pueden metabolizar los carbohidratos por la vía fermentativa o por la vía oxidativa; Cuando se encuentran en medios anóxicos fermentan o realizan respiración anaerobia si está disponible un aceptor final de electrones; las bacterias aerobias estrictas sólo pueden oxidarlos mediante respiración aerobia. Para detectar si las bacterias utilizan los carbohidratos por la vía oxidativa o fermentativa se utiliza el agar O/Fa con una alta concentración de un determinado hidrato de carbono, haciendo que los microorganismos utilicen para su desarrollo dicha sustancia. En vía oxidativa el aceptor final de electrones puede ser el oxígeno, por consiguiente el proceso es aerobio o una molécula inorgánica distinta del oxígeno como nitratos o sulfatos, en este caso es un proceso anaerobio. En la vía fermentativa el aceptor final de electrones es un compuesto orgánico y el proceso es anaerobio. La prueba O/F es empleada para evidenciar el metabolismo oxidativo o fermentativo de los carbohidratos por bacterias Gram negativa. Este medio contiene agar, peptona y azul de bromotimol como indicador de pH; inicialmente el medio es de color verde (pH 6,0 a 7,6); vira a amarillo cuando el medio se acidifica (pH menor a 6) y vira a color azul cuando el medio se alcaliniza (pH mayor a 7,6), estos cambios de color ayudan a evidenciar los productos de las vías metabólicas utilizadas por los microorganismos. La prueba de desnitrificación detecta respiración anaeróbica en la que se utiliza nitrato como último aceptor de electrones. Los nitratos pueden ser reducidos a nitritos, este a óxido nítrico y por ultimo ser reducido hasta nitrógeno molecular (N2). Los nitritos son detectados por NIT 1b y el NIT 2c; resultado positivo de esta prueba se observa con la presencia de un halo rojo, lo cual indica la reducción del nitrato hasta nitrito, por otro lado si esta da negativo indica que hay presencia de nitrato en el medio o fue reducido hasta óxido nítrico, óxido nitroso o nitrógeno molecular, este último se encuentra en estado gaseoso y se observa como burbujas. La prueba de Zinc nos permite determinar la presencia o ausencia de nitrato en el medio puesto que el Zinc es un ion metálico que reduce el nitrato. Si esta prueba es positiva se genera un halo rosa en el medio indicando que no hubo desnitrificación pues hay nitrato a. Prueba Oxidativo/Fermentativo b. NIT 1: Solución acética de ácido sulfanico c. NIT 2: Solución acética de ἀ-dimetilnaftilamina

Características metabólicas de E. coli y P. aeruginosa. Pseudomonas aeruginosa es una bacteria Gram negativa clasificada como aerobia estricta; sin embrago cuando se encuentra en condiciones anaerobias y presencia de nitrato, puede realizar respiración anaerobia6. Este microorganismo puede metabolizar glucosa ya que posee las enzimas necesarias; “en el caso de lactosa, la bacteria se ve incapacitada de metabolizarla por no tener la enzima ẞ-galactosidasa, por lo que degrada las peptonas rindiendo aminas fuertemente alcalinas, por lo cual el indicador azul de bromotimol tiñe el medio de azul”5. Escherichia coli y otras bacterias aerobias facultativas, puede realizar respiración aerobia en presencia de oxígeno utilizando esta molécula como último aceptor de electrones. En ausencia de oxígeno, pueden realizar fermentación de glucosa o lactosa, o realizar respiración anaerobia en presencia de aceptores alternativos de electrones como los nitratos. Los microorganismos prefieren emplear la ruta metabólica que representa mayor rendimiento energético siendo esta la respiración aerobia (36ATP), seguida de la respiración anaerobia (18ATP) y finalmente la fermentación (2ATP), siempre y cuando disponga de los elementos necesarios como oxígeno y aceptores de electrones. Por lo anterior, en condiciones anoxicas E. coli realizará respiración anaerobia si dispone del aceptor final de electrones, si no es así realizara fermentación.

Productos metabólicos Reacción

Color

No crecimiento

Verde

Acidificación Alcalinización

Amarillo Azul

Tabla 4. Reacciones típicas de bacterias Gram negativas en agar O/F. La respiración anaerobia genera CO2, agua y compuestos reducidos de las moléculas empleadas como aceptores finales de electrones2, en el caso del nitrato se genera nitrito, óxido de nitrógeno o nitrógeno molecular3. En la respiración aerobia se genera CO2 y agua1. En la fermentación se genera CO2 y ácidos orgánicos como ácido acético, acido butírico, ácido láctico, entre otros, los cuales acidifican el medio4. En los procesos anteriores se produce CO2, este compuesto puede reaccionar con el agua dando como resultado ácido carbónico, el cual acidifica el medio causando que el indicador de pH vire a amarillo; en algunos casos el CO2 puede acumularse y alcalinizar el medio, aquí el medio cambia a color azul. Análisis experimental

E. coli E. coli en presencia de oxigeno realiza respiración aerobia cuando hay lactosa y glucosa en el medio, porque posee la capacidad enzimática para metabolizar los dos carbohidratos. Sin embargo, E. coli es una bacteria aerobia facultativa que cuando esta en condiciones con menor concentración de oxigeno (en el fondo del tubo aerobio) puede realizar fermentación o respiración anaerobia si tiene disponible un aceptor final de electrones como el nitrato. Gracias a los productos de estos metabolismos el medio se acidifica, debido a los ácidos orgánicos generados en la fermentación y al ácido carbónico producto del CO2, virando el medio a color amarillo; es posible que debido a la acumulación de CO2 se alcalinice el medio y el indicador de pH vire a azul. En condiciones anaerobias, E.coli realiza fermentación si no dispone de un aceptor final de electrones, pero si este último está presente en el medio, se realiza respiración anaerobia; esto se debe a que la respiración anaerobia tiene mayor rendimiento energético que la fermentación, por esto E. coli preferirá realizar respiración anaerobia si tiene a su disponibilidad las condiciones necesarias. En el tubo de E. coli con lactosa + KNO3 en condiciones aerobias no se observa crecimiento al fondo del tubo, esto se debe a errores en la inoculación pues en este medio, el microorganismo disponía de las requerimientos necesarios para crecer y realizar respiración anaerobia. P. aeruginosa P. aeruginosa es una bacteria aerobia que presenta la particularidad de realizar respiración anaerobia en presencia de nitratos. En presencia de oxigeno con glucosa realiza respiración aerobia pues dispone de las enzimas para metabolizar este carbohidrato; sin embargo, en el fondo del tubo donde hay menor concentración de oxígeno, no hubo crecimiento pues no tiene disponible nitratos para realizar respiración anaerobia. En el medio con lactosa y KNO3 en presencia de oxígeno, se observó coloración azul, esto porque P. aeruginosa no puede metabolizar lactosa pues no dispone de las enzimas necesarias para hidrolizar el disacárido, por lo cual el microorganismo utiliza las peptonas liberando aminas que alcalinizan el medio. En la parte del tubo con mayor concentración de oxigeno realiza respiración aerobia utilizando las peptonas con fuente de carbono y nitrógeno; por otra parte en el fondo del tubo, donde hay menor concentración de oxígeno, realizó respiración anaerobia pues disponía de nitrato y de peptona como fuente de carbono y nitrógeno. En el tubo con glucosa y KNO3 en condición aerobia se observa respiración anaerobia en el fondo del tubo (poca concentración de oxigeno), gracias a la presencia de nitrato y peptonas. En la parte de arriba del tubo se observa un error en la inoculación, ya que no hubo crecimiento, sabiendo que en esta parte P. aeruginosa dispone de los elementos necesarios para su crecimiento como la presencia de oxígeno y un carbohidrato que puede ser metabolizado por esta.

En el tubo aerobio con lactosa, se observa error en la inoculación, ya que en este medio P. aeruginosa podría haber utilizado las peptonas disponibles y realizar respiración aerobia. En anaerobiosis P. aeruginosa solo presenta crecimiento cuando tiene disponible nitrato como último aceptor de electrones, ya que este microorganismo tiene la capacidad de realizar respiración anaerobia, aunque no posea las enzimas para degradar el carbohidrato del medio (lactosa), en este caso P. aeruginosa emplea las peptonas del medio como fuente de carbono y nitrógeno.

CONCLUSIONES En medio aerobio, E. coli realiza respiración aerobia sin importa el carbohidrato presente en el medio, sin embargo cuando la concentración de oxigeno es menor puede realizar respiración anaerobia si dispone de un aceptor final de electrones o fermentación si no dispone de este, lo cual ejemplifica la capacidad facultativa de este microorganismos. Aunque P. aeruginosa sea clasificada como aerobia estricta, tiene la particularidad de realizar respiración anaerobia en presencia de nitratos, si embargo la respiración aerobia tiene prioridad sobre la respiración anaerobia, pues la primera representa mayor rendimiento energético para la célula. P. aeruginosa no posee la capacidad para degradar lactosa por esto utiliza las otras fuentes de carbono disponibles en el medio, en este caso, las peptonas.

BIBLIOGRAFIA 1. Brock 2. https://es.diffen.com/ciencia/Respiracion-Aerobia-Anaerobia

3. https://es.wikipedia.org/wiki/Respiraci%C3%B3n_anaerobia 4. https://es.scribd.com/doc/7354774/Productos-de-Fermentacion 5. http://scielo.sld.cu/pdf/vac/v13n3/vac01304.pdf http://www.ucv.ve/fileadmin/user_upload/facultad_farmacia/catedraMicro/nitratos.p df 6. Referencia 7....