Informe 8. Crecimiento diáuxico de Escherichia coli en presencia de glucosa y lactosa PDF

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Informe de laboratorio del curso fisiología microbiana...

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CRECIMIENTO DIÁUXICO DE Escherichia coli EN PRESENCIA DE GLUCOSA Y LACTOSA

RESULTADOS CRUDOS Resultado prueba glucosa oxidasa (500 nm) Cultivo 1 Cultivo 2 Cultivo 1 Cultivo 2 0 0,024 0,021 0,116 0,106 80 0,014 0,011 0,076 0,081 0,032 0,037 0,095 0,092 125 185 0,15 0,075 0,062 0,088 215 0,121 0,116 0,068 0,092 0,198 0,171 0,095 0,067 255 282 0,223 0,229 0,04 0,046 316 0,321 0,322 0,034 0,03 340 0,449 0,471 0,006 0,001 372 0,571 0,582 0 0 Tabla 1. Resultados de la densidad óptica de E. coli y la determinación de glucosa en el medio mediante la prueba de Glucosa oxidasa, por espectrofotometría. Tiempo de cultivo (min)

Absorbancia cultivos E.coli (600 nm)

RESULTADOS PROCESADOS La concentración de glucosa del medio se calculó mediante la ecuación: 𝐶𝑔𝑙𝑢 𝐴𝑏𝑠𝑠500𝑛𝑚 𝑔𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑎 𝑐𝑜𝑠𝑎 = 𝐴𝑏 𝑛𝑚 ∗ 3.8 Donde, (Cglucosa) corresponde a la concentración de glucosa en la muestra, (Abs500nm) corresponde al valor de absorbancia obtenido a 500 nm de la muestra con la prueba de glucosa oxidasa. Cglucosa= (0,116) * 3,8 Cglucosa= 0,4408

Tiempo de cultivo (min)

Absorbancia cultivos E.coli (600 nm)

Resultado prueba glucosa oxidasa (500 nm)

Concentración de glucosa (mg/dL)

a. Estudiante de Microbiología Industrial y Ambiental. Escuela de Microbiología. Universidad de Antioquia. b. Docente encargado del Laboratorio de Fisiología Microbiana. Escuela de Microbiología. Universidad de Antioquia.

0,0125 0,0785 0,2983 80 125 0,0345 0,0935 0,3553 0,1125 0,075 0,285 185 215 0,1185 0,08 0,304 0,1845 0,081 0,3078 255 282 0,226 0,043 0,1634 0,3215 0,032 0,1216 316 340 0,46 0,0035 0,0133 0,5765 0 0 372 Tabla 2. Promedio de la densidad óptica de E. coli en los dos cultivos y promedio de la concentración de glucosa del medio en los dos cultivos.

Grafico 1. Crecimiento de E.coli en presencia de Glucosa y lactosa; y concentracion de Glucosa en el medio en función del tiempo.

ANALISIS La grafica muestra un creciemiento diáuxico para el cultivo de E. coli1, este tipo de crecimiento tiene lugar cuando E. coli crece en un medio con dos fuentes de carbono, en

este ensayo se utilizo glucosa y lactosa, siendo preferente la glucosa a la lactosa en el metabolismo de E. coli, debido a la facilidad asimilativa del monosacarido1. Apartir del minuto 80 se evidencia el inicio de la primera fase de creciemiento exponencial, hasta los 185 minutos, en este intervalo de tiempo E. coli utiliza la glucosa como fuente de carbono, dado que en este lapso de tiempo, la concentracion de glucosa disminuye en el medio. La fase estacionaria representada entre las dos fases exponenciales (entre el minuto 185 y 215), es el tiempo que tardó E.coli en expresar los genes para el catabolismo de la lactosa, momentos antes del agotamiento de glucosa. A partir de 215 minutos hasta 372 minutos, se observa la segunda fase exponencial, donde E. coli emplea el disacarido lactosa como fuente de carbono. La glucosa es un combustible metabólico para E. coli; cantidades adecuadas de glucosa, inhiben la expresión de genes que sintetizan proteínas necesarias para el metabolismo de otros catabólitos como la lactosa, arabinosa y galactosa, aun cuando están en concentraciones elevadas. Este fenómeno se conoce como represión catabólica o “efecto glucosa”, el cual evita el gasto de energía en la síntesis de enzimas que no se utilizan en la célula a menudo2. La expresión de información genética está sometido a algún tipo de regulación; en el caso de E. coli, la regulación se presenta en la transcripción; este se da por la interacción de proteínas reguladoras sobre secuencias de ADN, donde ocurren fenómenos de inducción genética y de represión genética. La inducción permite el ajuste rápido para el uso de sustratos metabolizables y la represión permite el ajuste para la síntesis de moléculas que intervienen como intermediario metabólico2. El catabolismo de la glucosa “impide” que se expresen los genes del Operón de la lactosa (Operón lac). Una vez que la concentración de glucosa disminuye hasta cantidades mínimas, el Operón lac se activa y se sintetizan las enzimas que permiten metabolizar la lactosa, únicamente si se encuentra presente en el medio3. Durante la curva de crecimiento, la concentración de glucosa del medio disminuye, teniendo en cuenta que no es necesario que la glucosa se agote totalmente en el medio para iniciar la expresión génica del Operon lac. El Operón lac, está constituido por un solo promotor y tres genes: El Gen lacZ que codifica la enzima ß-galactosidasa, la cual hidroliza la lactosa en galactosa y glucosa; el Gen lacY que determina la enzima ß-galactósido permeasa, una proteína de membrana encargada del transporte lactosa al interior de la célula; y el Gen lacA que codifica para la enzima ß-galactósido acetilasa, que tiene funciones desconocidas. Además, contiene dos reguladores que "encienden" y "apagan" el Operón lac en respuesta a los niveles de lactosa y de glucosa, que son el represor lac y la proteína activadora por catabolito (CAP)4. La proteína CAP actúa como un sensor de la glucosa y funciona como regulador positivo, el cual activa la transcripción del Operón lac solamente cuando los niveles de glucosa son bajos, ya que, en estas condiciones se produce la molécula AMPc, esta es un segundo mensajero que es identificado por la proteína CAP, permitiendo la detección indirecta de la glucosa4.

El represor lac actúa como un sensor de la lactosa y regulador negativo, este bloquea la transcripción del Operón y deja de actuar como represor cuando la lactosa está presente; el represor lac detecta la lactosa indirectamente a través de su isómero alolactosa4.

Imagen modificada de "Regulación génica procariota: Figura 3", de OpenStax College, Biología (CC BY 4.0).

En presencia de glucosa y lactosa, el represor lac es liberado del operador, ya que el inductor (alolactosa) está presente. Los niveles de AMPc son bajos porque la glucosa está en el medio; por esto, la mayor parte de CAP permanece inactiva y no puede unirse al ADN para la transcripción de los genes necesarios en el metabolismo de lactosa como fuente de carbono. Por lo anterior, la transcripción del Operón lac se da en niveles bajos3.

En ausencia de glucosa y presencia de lactosa, el represor lac es liberado del operador ya que el inductor (alolactosa) está presente. Los niveles de AMPc son altos porque no hay glucosa en el medio, así que CAP está activa y unida al ADN. CAP activada, ayuda a que la ARN polimerasa se una al promotor y aumentan los niveles de transcripción del Operón lac3. Imagen modificada de "Regulación génica procariota: Figura 3", de OpenStax College, Biología (CC BY 4.0).

CONCLUSIÓN E. coli mostró un crecimiento diáuxico en presencia de glucosa y lactosa, gracias a los mecanismos de expresión génica que le hacen posible utilizar como fuente de carbono y energía dos tipos de carbohidratos, corroborando que E. coli elige los compuestos que representan mayor facilidad asimilativa, como es el caso de la glucosa frente a la lactosa. Para utilizar la lactosa, las bacterias deben expresar los genes del Operón lac, que codifica enzimas claves para el consumo y el metabolismo de la lactosa. Para ser tan eficiente como sea posible, E. coli debe expresar el Operón lac solamente cuando se

cumplan dos condiciones, que la lactosa esté disponible, y que la glucosa se este agotando. En estas condiciones, este sistema se revierte, es decir, permite el “encendido” de los genes del Operon lac a través de un mecanismo de activación e inactivación de CAP dependiente de AMPc. La unión del activador y la liberación del represor, permiten que la ARN polimerasa se una al promotor y le dé una trayectoria de transcripción sobre el Operón lac, permitiendo la producción de enzimas necesarias para el metabolismo de la lactosa. BIBLIOGRAFÍA

1. https://es.scribd.com/document/352647119/CRECIMIENTO-DIAUXICO 2. https://www.google.com.co/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=4&cad=rja&uac t=8&ved=0ahUKEwi7u_rrpZnXAhVNl5AKHdczBf0QFggyMAM&url=https%3A%2F%2Fwww. ugr.es%2F~eianez%2FMicrobiologia%2F15regulacion.htm&usg=AOvVaw1yRFZIW5Xbl5Snl djilJtE 3. https://es.khanacademy.org/science/biology/gene-regulation/gene-regulation-inbacteria/a/the-lac-operon 4. Buscar referencia...