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El trabajo de investigación es un proceso que, mediante la aplicación del método científico, está encaminado a conseguir información medible para concebir, comprobar, corregir o ampliar el conocimiento....

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Fermentación Propiónica y Butírica

Jimenez Ocaña, Karol Flores Abat, Mishel Feliciano Salvador, Ronald Nario Ortiz, Jean Pierre Espinoza Rosas, Sebastian Alejandro Rivera, Kevin

Universidad Nacional José Faustino Sánchez Carrión 3505302: Biotecnología para Ingenieros Químicos Ing. Robert William Ocrospoma Dueñas

17 de Setiembre de 2021

Índice Introducción ........................................................................................................................... 3 Capítulo 1 Fermentación Propiónica ......................................................................................... 4 1.1. Primeros estudios ........................................................................................................ 4 1.2. Estudios posteriores..................................................................................................... 5 1.3. ¿Qué es la fermentación propiónica? .......................................................................... 5 1.4. Generalidades .............................................................................................................. 5 1.5. Tipo de microorganismos que intervienen .................................................................. 6 1.6. Vía metabólica de formación de ácido propiónico por Propionibacterium ................ 7 1.6.1. Etapa 1: Glucolisis. .................................................................................................. 7 1.6.2. Etapa 2: De piruvato a oxalacetato. ......................................................................... 8 1.6.3. Etapa 3: De oxalacetato a malato. ........................................................................... 8 1.6.4. Etapa 4: De malato a fumarato. ............................................................................... 8 1.6.5. Etapa 5: De fumarato a succinato. ........................................................................... 9 1.6.6. Etapa 6: Obtención de ácido propiónico.................................................................. 9 1.7. Obtención de ácido acético como subproducto ......................................................... 10 1.8. Principal objetivo de la fermentación propionica ..................................................... 11 1.9. Usos y aplicaciones del ácido propionico ................................................................. 11 Capítulo 2 Fermentación Butírica ............................................................................................ 12 2.1. Historia ...................................................................................................................... 12 2.2. ¿Qué es la fermentación butírica? ............................................................................. 14 2.3. Tipos de microorganismos que intervienen .............................................................. 14 2.4. Vía metabólica de la formación de ácido butírico por Clostridium .......................... 15 2.4.1. Fase 1: Obtención de piruvato a través de la glucolisis. ........................................ 15 2.4.2. Fase 2: Escisión del piruvato. ................................................................................ 16 2.4.3. Fase 3: Condensación de acetilcoenzima A con acetilcoenzima A. ...................... 16 2.4.4. Fase 4: Paso de acetoacetilcoenzima A a -hidroxibutinilcoenzima A................. 16 2.4.5. Fase 5: Deshidratación de -hidroxibutinilcoenzima A. ....................................... 17 2.4.6. Fase 6: De butenilcoenzima A a butirilcoenzima A. ............................................. 17 2.4.7. De butirilcoenzima A a butirilfosfato. ................................................................... 17 2.4.8. De butirilfosfato a ácido butírico. .......................................................................... 18 2.5. Obtención de ácido acético ....................................................................................... 18 2.6. Obtención de butanol, acetona e isopropanol............................................................ 19 2.7. Características del ácido butírico .............................................................................. 21 2.8. Usos y aplicaciones del ácido butírico ...................................................................... 21 2.8.1. En la industria alimentaria y farmacéutica. ........................................................... 21 2.8.2. Síntesis de productos químicos.............................................................................. 22 Capítulo 3 Referencias Bibliográficas ..................................................................................... 23

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Introducción La presente monografía plasma el contenido de la fermentación propiónica y butírica, que ha sido elaborado por un grupo de alumnos del V ciclo para el curso de Biotecnología para ingenieros. La fermentación implica utilizar microorganismos para transformar la materia orgánica, catalizadas por enzimas. Un alimento se considera fermentado cuando uno o más de sus componentes químicos son atacados por microorganismos, considerados útiles, por lo que su composición química resulta modificada. La fermentación se puede definir como la transformación que sufren ciertas materias orgánicas bajo la acción de enzimas segregadas por microorganismos. Se trata pues de un proceso de naturaleza bioquímica. La fermentación tiene lugar en ambiente anaeróbico, con degradación de la sustancia orgánica en compuestos intermedios que actúan de donadores y aceptores de electrones (proceso de óxido-reducción) con liberación de energía. En este trabajo de investigación conoceremos más sobre de como actúa la fermentación propiónica y butírica, tanto también como de su empleo en nuestro ámbito de la ingeniería.

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Fermentación Propiónica 1.1. Primeros estudios Los primeros estudios sobre la fermentación propiónica de azúcares se deben a Orla-Jensen (1889), quien revelo que era la causa de la formación de ojos en el queso en Emmenthal. Sheman y Saw (1923, 1924) obtuvieron cultivos puros de bacterias del ácido propiónico. Virtanen (1925) fue el primero en investigar el mecanismo de fermentación posiblemente responsable tanto de la producción de ácido propiónico como de la formación concomitante de CO2 procesos ambos implicados en producción de este tipo de queso. Finalmente, los estudios taxonómicos de Van Niel permitieron definir el género Propionibacterium en el que se incluyen todas las bacterias del grupo propiamente dicho.

Figura 1: De derecha a izquierda. Orla Jensen, Virtanen y Van Niel

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1.2. Estudios posteriores Carbonero (s.f.) nos dice que la fermentación propiónica se ha estudiado intensamente en los laboratorios de Wood y Lynen. Las fermentaciones de Propionibacterium en sus primeras etapas, exhiben un exceso de productos oxidados y altas recuperaciones de carbono (107%). Eventualmente, se descubrió que el C03Ca añadido al medio para tamponarlo, desaparecía durante la fermentación. Wood y colaboradores en 1941, establecieron que el 14CO2 se fijaba en los carboxilos de succinato durante la fermentación de glicerina. Históricamente esta fue la primera demostración de fijación heterotrófica de CO 2. Estudios de fermentaciones de Propionibacterium con glucosa radiactiva indican que la ruta fermentativa seguida es compleja. 1.3. ¿Qué es la fermentación propiónica? Es el proceso mediante el cual se genera ácido acético (CH3OOH), dióxido de carbono (CO2) y ácido propiónico (CH3CH2COOH), como productos finales. La ruta fermentativa la presentan las bacterias Propinobacterium y otras anaerobias presentes en el rumen de herbívoros. Esta es la fermentación mediante la cual se produce el queso suizo. 1.4. Generalidades 

Los productos principales de la fermentación de la glucosa son los ácidos propiónico y acético.



Es la conversión del piruvato a oxalacetato por carboxilación, a través de succinato y succinil-CoA a metilmalonilCoA y propionil-CoA.

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1.5. Tipo de microorganismos que intervienen Esta es una fermentación realizada por especies del género Propionibacterium, Gram +, sin esporas y anaeróbicas. Las 8 principales especies del género Propionibacterium que intervienen son: 

Propionibacterium freudrenreichii



Propionibacterium jesenii



Propionibacterium sehrmanii



Propionibacterium pentosaceum



Propionibacterium rubrum



Propionibacterium thoenii



Propionibacterium technicum

Tabla 1 Fermentaciones por propionibacterias Ácido Acético (CH3COOH)

Dióxido de Carbono (CO2)

Organismo

Sustrato

Ácido Propiónico (CH3CH2COOH)

P. freudenreichii

Glucosa

134.0

52.6

49.2

P. freudenreichii

Lactato

63.5

35.3

35.8

P. freudenreichii

Glicerol

100.0

9.9

6.9

P. shermanii

Glucosa

140.0

56.8

56.4

P. shermanii

Lactato

62.5

36.5

37.0

P. shermanii

Glicerol

102.0

10.6

7.3

P. paterssonii

Glucosa

114.0

54.0

51.0

P. arabinosum

Glucosa

148.0

10.0

63.6

Fuente: Van Niel, C. (1928). Ph. Thesis, Technische Hoogeschool, Werkam Biochem.

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1.6. Vía metabólica de formación de ácido propiónico por Propionibacterium 1.6.1. Etapa 1: Glucolisis. Consideramos a la glucolisis como la primera etapa de la formación de ácido propiónico, a través de ella vamos a obtener el piruvato o ácido pirúvico. La ecuación general y balanceada de la glicolisis es la siguiente:

Figura 2. Ecuación general de la glucolisis Fuente. Autoría propia Como podemos observar en la Figura 2, en la glucolisis se degrada una molécula de glucosa hasta dos moléculas de piruvato o ácido pirúvico, pero para producir la fermentación propiónica, el poder reductor requerido para la reducción de dos moles de piruvato a dos moles de propiónico debe ser suministrado por el metabolismo de 1,5 moles de glucosa para de esta manera poder formar 3 moléculas de piruvato, de los cuales 1 de ellas nos va a dar los otros dos productos de está fermentación, como son el ácido acético y el dióxido de carbono.

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1.6.2. Etapa 2: De piruvato a oxalacetato. En esta etapa 2, como lo hemos denominado, el piruvato se convierte en oxalacetato, esto gracias a la encima transcarboxilasa.

Figura 3. Paso de piruvato a oxalacetato Fuente. Autoría propia 1.6.3. Etapa 3: De oxalacetato a malato. En esta etapa se da el paso del oxalacetato al malato, gracias a la enzima malato deshidrogenada

Figura 4. De oxalacetato a malato Fuente. Autoría propia

1.6.4. Etapa 4: De malato a fumarato. En esta etapa, se produce una deshidratación del malato para de esta manera obtener el fumarato.

Figura 5. De malato a fumarato Fuente. Autoría propia

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1.6.5. Etapa 5: De fumarato a succinato. En esta etapa se da el paso de fumarato a succinato, gracias a la acción de la enzima fumarato reductasa.

Figura 6. De fumarato a succinato Fuente. Autoría propia

1.6.6. Etapa 6: Obtención de ácido propiónico. En esta última etapa obtendremos el ácido propiónico, gracias a la reacción del succinato con el propionil CoA, obtenido en la etapa 2, anteriormente explicado, no solo obtendremos ácido propiónico sino también succinil CoA, que se convierte en metilmalonil CoA gracias a la enzima isomerasa y está molecula posteriormente volverá a reaccionar con el piruvato para seguir con la producción de ácido propiónico.

Figura 7. Obtención de ácido propionico Fuente. Autoría propia

Figura 8. Isomerización de succinil CoA Fuente. Carbonero, P. (s.f.)

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1.7. Obtención de ácido acético como subproducto Como explicamos anteriormente, utilizamos 1.5 moles de glucosa para la formación de 3 moles de piruvato, de los cuales 2 moles de ello lo utilizamos para obtener 2 moles de ácido propionico, pero ahora nos preguntamos: ¿Dónde quedo el mol de piruvato? Pues el mol de piruvato que queda es empleado para la formación de ácido acético y dióxido de carbono como subproductos en esta fermentación.

Figura 9. Obtención de ácido acético Fuente. Autoría propia

Figura 10. Fermentación propionica Fuente. Carbonero, P. (s.f.)

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1.8. Principal objetivo de la fermentación propionica En las industrias alimenticias del queso, se llevan procesos de fermentación propiónica. Esta es la fermentación mediante la cual se produce el queso suizo, el sabor peculiar se lo dan los ácidos y los huecos se deben a la gran producción de CO2.

Figura 11. Queso Suizo Fuente. Múcio Furtado, (s.f.)

1.9. Usos y aplicaciones del ácido propionico Se utiliza profusamente como conservante. El ácido propanoico inhibe el crecimiento de moho y de algunas bacterias. Por eso la mayoría del ácido propílico producido se utiliza como conservante para el pienso y para alimentos de consumo humano. Para el pienso se utiliza directamente, o como su sal de amonio. En los alimentos humanos, especialmente el pan y otras mercaderías cocidas al horno, se utiliza su sal de sodio o de calcio. También fue utilizado de manera similar en algunos de los polvos antimicóticos para los pies.; como producto químico intermedio, puede ser usado para modificar fibras sintéticas de celulosa; e incluso como pesticida o formando parte de distintos productos farmacéuticos. Los ésteres del ácido propílico se usan a veces como disolventes o condimentos artificiales.

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Fermentación Butírica 2.1. Historia Peloze y Gélis (s.f.) se refiere que según los métodos antiguos: Se mezclaba una disolución de azúcar al 10% con creta, a esta mezcla se le agregaba queso rancio para determinar la fermentación a 25 ó 30°C. Las primeras investigaciones acerca de la fermentación butírica son debidas a PASTEUR en 1861, quien estableció que ésta empezaba por una fermentación láctica y que el lactato de calcio formado previamente se transformaba después en butirato de calcio. Lieben y Rossi en 1869 siguiendo los antiguos métodos en que se partía para preparar ácido butírico de engrudo de almidón y carne podrida, trabajaron del modo siguiente: Cuácense 5 kg, de almidón de arroz con 60 latas de agua por algunas horas, enfriar y, agregar 6 grs. de malta diluidos en 2 latas de leche, con 1 kg de carne picada y 2 kg de creta para combinar con el ácido formado, se abandona por algunas semanas a 2530°C cuando cesa el desprendimiento de CO, se filtra y se cuese el filtrado. Así precipita el butirato de calcio que siendo muy soluble en agua fría lo es poco en agua caliente mientras que el acetato y el capronato de calcio se mantienen en disolución. Filtrar a la temperatura de ebullición, el butirato calcio reconocido se descompone en ácido clorhídrico concentrado; o se precipita con sosa, y el butirato de sodio se descompone con ácido sulfúrico. El ácido butírico bruto se fracciona. En 1879 PRIBAN modifica el método mezclando el engrudo del almidón con 60 latas de agua, 600 grs. de hígado de ternera, purgado de sangre finamente picado y abandonando la mezcla a 35-40°C al cabo de algunas horas se agrega 1.5 kg de creta. La fermentación termina a los 14 días.

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La obtención del ácido butírico en gran escala recomendaba al principio estos métodos. La materia prima, engrudo de almidón o patatas trituradas y hervidas, se revolvía con agua a la que se agregaba algo de ácido tartárico para la inversión y se inicia la fermentación agregando al cabo de algunos días carne podrida o queso en descomposición, o se deja en un sitio caliente leche magria agriada adicionada con creta, respondiendo de vez en cuando el agua evaporada como producto de intermedio se forma ácido láctico con lo que se separa del líquido lactato cálcico. Avanzado suficientemente la fermentación, se desvanece gradualmente el lactato cálcico y la solución contiene butirato cálcico. Tratándose la sal de calcio con ácido clorhídrico o ácido sulfúrico transformándola en compuesto sódico por adición de sosa. Descomponiendo ese compuesto en un ácido mineral, se libera ácido butírico, que puede purificarse por destilación. En 1930, NEUBERG y ARIESTEIN informan que el ácido butírico y el butanol se forman a partir de la glucosa y la glicerina, pasando por etapas intermedias de ácido pirúvico y alcohol pirúvico. En 1931, KLUYVER y colaboradores formulan un esquema para la fermentación butírica, en la cual los productos finales son ácido butírico, dióxido de carbono, hidrógeno e indicios de ácido fórmico. Para la obtención de ácido butírico en gran escala se parte del almidón (fécula de patata, arroz o maíz), la materia feculanta es fermentada directamente por ciertas bacterias. La glucosa se suele preparar en la misma fábrica, mostificando el almidón, como en las fábricas de alcohol, a 57-60°C, con malta finamente desmenuzada y diluida en agua. En lugar de la sacarosa pura se emplean residuos de fabricación y especialmente melazas. La fermentación se produce en grandes cubas, bajo la influencia de bacterias butíricas

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cuidadosamente seleccionadas que se conservan en cultivo puro, y con todas las precauciones necesarias para la pureza del proceso. 2.2. ¿Qué es la fermentación butírica? Se define la fermentación butírica como la degradación de la glucosa (C 6H12O6) para producir ácido butírico (C4H8O2) y gas, en condiciones anaeróbicas y con un bajo rendimiento energético. Es característica por la producción de olores desagradables y pútridos. Es característica por acción de bacterias anaerobias de la especie Clostridium butyricum y Bacillus amilobacter en ausencia de oxígeno. 2.3. Tipos de microorganismos que intervienen La fermentación butírica es llevada a cabo por bacterias Gram positivas, productoras

de

esporas,

del

género

Clostridium,

típicamente

por

Clostridium butyricum, Clostridium tyrobutyricum, Clostridium thermobutyricum, además de Clostridium kluyveri y Clostridium pasteurianum. Sin embargo, también se han reportado como productoras de butirato otras bacterias clasificados en los géneros Butyrvibrio, Butyribacterium, Eubacterium, Fusobacterium, Megasphera y Sarcina.

Figura 12. Clostridium Fuente. https://www.totalfood.com.ar/es/blog/que-es-la-bacteria-de-clostridium

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Tabla 2 Clasificación de las principales especies del genero clostridium productores de ácido butírico

Por la posición de su espora

Licuación de la gelatina

Grupos

No Hidrolizado

I

Hidrolizado

II

No Hidrolizado

III

Hidrolizado

IV

Subterminal I

Terminal II

Principales especies

Clostridium Butyricum Clostridium Beijerinckii Clostridium Rectum Clostridium Rubrum Clostridium Fallax Clostridium Pasteurianum Clostridium Sticklandii Clostridium Tyrobutyricum Clostridium Ghoni Clostridium Lituseburense Clostridium Sporogenes Clostridium Plagarum Clostridium Acetobutylicum Clostridiumfelsineum Clostridium Scatologenes Clostridium Sartagoformun Clostridium Thermosaccharglyticum Clostridium Sporosphaeroides Clostridium Barkeri Clostridium Lentoputrescens Clostridium Oceanicum

Fuente: Pacheco y Yesquen (2011) 2.4. Vía metabólica de la formación de ácido butírico por Clostridium 2.4.1. Fase 1: Obtención de piruvato a través de la glucolisis. Considera...