Guía práctica de Bioquímica PDF

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GUÍA DE LABORATORIO 201 9 – IGUÍA DE LABORATORIOCURSO: BIOQUÍMICAGUÍA DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA© Derechos Reservados 2018© Área de QuímicaTercera Edición Segunda reimpresiónDiseño, Diagramación e ImpresiónUniversidad Científica del SurPanamericana Sur Km 19. Lima – PerúTeléfono: 610 – 6400Tiraje 15...

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GUÍA DE LABORATORIO 2019 – I

GUÍA DE LABORATORIO CURSO: BIOQUÍMICA 0

Autores: Salazar, J.; Salazar, Y.

GUÍA DE LABORATORIO 2019 - I

GUÍA DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA © Derechos Reservados 2018 © Área de Química

Tercera Edición Segunda reimpresión

Diseño, Diagramación e Impresión Universidad Científica del Sur Panamericana Sur Km 19. Lima – Perú Teléfono: 610 – 6400

Tiraje 1500 ejemplares IMPRESO EN PERÚ

GUÍA DE LABORATORIO 2019 – I

Dr. Manuel Efraín Rosemberg Barrón Rector

Dr. Christian Jesús Mesías Montenegro Vicerrector Académico

Dr. José Agustín Ortiz Elías Director General Académico

Mg. Álvaro Rodrigo Pinillos Osnayo Director de Formación Básica

Mg. Juan Alberto Salazar Sánchez Coordinador de Área de Química y Física

Autores: Mg. Juan Alberto Salazar Sánchez Bach. Yojani Bereniz Salazar García

Reservados todos los derechos: ningún material de este manual puede ser reproducido sin autorización expresa por escrita por los autores. La autorización será en hoja aparte y firmada y adosada a este material. Todo compromiso suscrito aparte, no se refiere a este manual. Queda exento del compromiso, el fotocopiado interno en una cantidad no mayor de 100, solo para uso con fines educativos y sin lucro.

GUÍA DE LABORATORIO 2019 – I

CONTENIDO

Prologo

1

Instrucciones generales y medidas de bioseguridad

2

CAPÍTULO 1. Espectrofotometría

7

CAPÍTULO 2. Factores que afectan la actividad enzimática

14

CAPÍTULO 3. Determinación de ácido úrico en suero sanguíneo

21

CAPÍTULO 4. Digestión enzimática del almidón

25

CAPÍTULO 5. Efecto del ayuno en el glucógeno hepático

31

CAPÍTULO 6. Cálculo del balance energético

46

CAPÍTULO 7. Hidrólisis de lípidos

51

CAPÍTULO 8. Determinación de triglicéridos y colesterol en suero

58

CAPÍTULO 9. Determinación de HDL y LDL en plasma

58

CAPÍTULO 10. Determinación de proteínas plasmáticas

58

CAPÍTULO 11. Determinación de vitamina C en alimentos vegetales

63

CAPÍTULO 12. Determinación de hemoglobina y urea

68

0

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GUÍA DE LABORATORIO 2019 - I

PROLOGO

La química es una ciencia activa y en continuo movimiento; tiene una importancia fundamental para nuestro mundo, tanto en el ámbito de la naturaleza como de la sociedad. Sus orígenes son muy antiguos, p ero como se verá en este curso, es también una ciencia moderna y en continua renovación. La enseñanza de la Química equilibra el desarrollo teórico de sus conocimientos con el trabajo experimental de Laboratorio como curso básico que se imparte a los estudiantes de las diferentes Facultades de la Universidad

Científica

del

Sur, motivo por el cual la "GUIA DE

LABORATORIO DE BIOQUÍMICA " está orientada exclusivamente hacia el desarrollo de prácticas experimentales, con la finalidad de que el alumno complemente

conocimientos,

manipulación

de

genere

habilidades

y

destrezas

materiales, equipos e instrumental

incentivando así la adquisición de los hábitos del método

de

en

la

Laboratorio, científico -

observando los fenómenos que ocurren en los ensayos respectivos y tomando datos necesarios para obtener resultados y conclusiones confiables. Al término de cada práctica se propone un cuestionario de preguntas teóricas y problemas variados, con el objetivo de reforzar los conocimientos adquiridos en el desarrollo de las prácticas de Laboratorio realizadas.

Los Autores

1

Autores: Salazar, J.; Salazar, Y.

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INSTRUCCIONES GENERALES Y MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD

1. LABORATORIO DE QUÍMICA 1, 2, 3 y 4 UCSUR El Laboratorio es un ambiente físico estratégico donde se desarrolla diferentes experimentos, con la finalidad que el alumno comp lemente conocimientos, genere habilidades y destrezas en la manipulación de materiales, equipos e instrumental de laboratorio, incentivando así la adquisición de los hábitos del método científico- observando los fenómenos que ocurren en los ensayos respectivos y tomando d atos necesarios para obtener resultados confiables.

2. INSTRUCCIONES PARA EL TRABAJO EN EL LABORATORIO 

Llegar puntual a las prácticas (tolerancia 5 minutos).



Leer con anticipación la Práctica a realizar.



Cada sesión de Laboratorio genera un Informe; el que será entregado en la siguiente práctica en su respectivo horario. Es la única fecha y la entrega es de carácter obligatorio. El informe se debe desarrollar de acuerdo a formato que se encuentra en la Guía de Práctica.



La inasistencia injustificada a cualquier práctica impide al alumno la p resentación del informe correspondiente y por lo tanto tendrá la nota mínima de cero.



El alumno con inasistencia justificada deberá recuperar la práctica durante la misma semana para lo que recabará de su profesor de prácticas el formato de autorización correspondiente.

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3. MEDIDAS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO a) Higiene personal

 Queda terminantemente prohibido fumar, comer y/o beber durante las prácticas en el laboratorio. Así mismo el uso de celulares y otros equipos electrónicos.

 Se debe lavar las manos al finalizar el trabajo de laboratorio y cada vez que se sospecha que ha estado en contacto con algún material contaminado.

 Al entrar en contacto la piel con ácidos o bases fuertes, lavarse inmediatamente con abundante agua. Para el caso de ácidos aplicarse una solución saturada de bicarbonato, para las bases utilice una solución al 5% de ácido acético (vinagre).

 Para quemaduras leves el área afectada se debe aplicar inmediatamente una crema de picrato de Butesín.

 Mantener limpio el área de trabajo. Al derramar alguna sustancia limpiar inmediatamente. Al final de la práctica dejar todo el material limpio y ordenado. b) Comportamiento de los alumnos durante las prácticas 

Está terminantemente prohibido ingresar a l

Laboratorio

mochilas, carteras o bolsos, teléfono celulares, animales domésticos, etc. 

Una vez que el alumno haya ingresado al laboratorio no puede salir por ningún mo tivo.



El trabajo con sustancias volátiles se debe realizar haciendo uso de la campana extractora.



Para diluir ácidos, siempre se debe agregar los ácidos al agua, y no en sentido contrario.



Cuidar como propio todo bien que encuentre o utilice en el laboratorio. El alumno es responsable de los materiales asignados para el desarrollo de la práctica, el deterioro implica su reposición obligatoria.

 3

El manejo de materiales, reactivos y el desarrollo de los Autores: Salazar, J.; Salazar, Y.

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experimentos sólo se realizan con autorización del profesor. Los experimentos no autorizados están prohibidos. 

Observar cuidadosamente que los frascos con reactivos estén etiquetados indicando el contenido y la concentración respectiva, antes de ser usados.



Obtener las sustancias químicas de los frascos de reactivos, en un vaso de precipitados o en u n tu b o d e e n s a y o s l im p i o , c u i d a n d o d e no usar cantidades mayores que las necesarias,

está

terminantemente

prohibido

regresar

sustancia alguna no utilizada al frasco original. 

Al encender el mechero Bunsen, primero encender el fósforo y luego abrir la llave de gas.

c) Eliminación de residuos 

Los desechos sólidos, líquidos y las sales solubles, deben ser depositados en los recipientes indicados por el profesor para su posterior tratamiento.



Todo

desperdicio de papel o residuo sólido debe dirigirse al

respectivo recipiente

de

basura

situados

en

ambas

paredes laterales de cada Laboratorio 

No se debe arrojar residuos sólidos al lavadero.

4. ELEMENTOS DE PROTECCIÓN PERSONAL Y DE LOS EQUIPOS a) Mandil 

Para cada sesión de prácticas el estudiante debe llevar un mandil (guardapolvo), el cual es de carácter obligatorio. Cuando el experimento lo amerite, los estudiantes usarán lentes de seguridad industrial tipo MERCK.



Los estudiantes vestirán sus mandiles antes de ingresar al Laboratorio y dejarán de vestirlos a la finalización de las actividades correspondientes.

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b) Lentes de seguridad y respiradores 

Se debe usar lentes de seguridad cuando sea necesario proteger la cara de salpicaduras y/o sustancias corrosivas. Igualmente se utilizará respiradores cuando sea necesario. En ambos casos el estudiante tiene a su disposición estos materiales y los solicitará al responsable del laboratorio.



En la parte lateral central del Laboratorio se encuentra la ducha española, la que será

usada para casos de salpicaduras o

derrames en el cuerpo de la víctima con sustancias ácidas, básicas o corrosivas. Así mismo a la entrada parte izquierda se encuentra un kit lavador de ojos que se aplicará directamente al oj o de la víctima en caso de salpicadura de alguna sustancia dañina al ojo. c) Extinguidores contraincendios 

El alumno debe conocer el uso y la ubicación de los extintores contra incendios que en caso de emergencia se descolgará de la pared con cuidado. El extintor, en la parte superior tiene una palanca circular que se saca (se tira) para activar y se presiona la manija con la mano derecha y con la mano izquierda se coge la manguera la cual se orientará hacia la fuente de peligro.



En el caso de incendiarse la ropa de una persona, se deberá pedir ayuda inmediatamente, se debe estirar en el piso y rodar sobre sí mismo para apagar las llamas. No se recomienda utilizar el extintor sobre el cuerpo o rostro de una persona.

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d) Botiquín de primeros auxilios 

Existe un botiquín perfectamente identificado y de fácil acceso cono los elementos necesarios para prestar primeros auxilios en el laboratorio.



Será responsabilidad de todos los usuarios del laboratorio conocer la ubicación y el uso del botiquín y de los elementos de protección personal.

5. TOMA DE DATOS 

Manipular con habilidad, criterio y en forma adecuada los diferentes materiales de laboratorio.



Desarrollar los experimentos en forma ordenada y con mucha responsabilidad.



Observar con mucho cuidado los fenómenos que ocurren durante el desarrollo de los experimentos.



Realizar

las

mediciones

con

precisión

y

efectuar

las

anotaciones pertinentes, para obtener resultados satisfactorios disminuyendo el margen de error. “un error mínimo al principio puede ser máximo al final” (Aristóteles). 

Todo alumno deberá contar con una calculadora personal que contenga como mínimo funciones de potencia y logaritmo. No se permitirá usar celulares como calculadora personal.

6. SISTEMA DE EVALUACIÓN Laboratorio: 35% RUBRO

6

%

Control de aprendizaje I

10

Control de aprendizaje II

10

Informes

5

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CAPÍTULO

1 ESPECTROFOTOMETRÍA

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PRÁCTICA N°1 ESPECTROFOTOMETRÍA

Logro de aprendizaje:

Conocimiento el uso y aplicación del espectrofotómetro. Aplicación de la ley de Lambert – Beer en el empleo del espectrofotómetro. Determinación de una curva de calibración con la solución de azul de metileno. MATERIALES

I. MATERIALES EN LA MESA DE LOS ESTUDIANTES    

01 gradilla 05 tubos de ensayo 13x100mm 01 piseta con agua destilada 02 pipeta graduada 10mL

II. MATERIALES EN LA MESA CENTRAL DEL PROFESOR     

01 solución de azul de metileno 1mg/dL frasco 100mL 01 espectrofotómetro 01 micropipeta 100-1000 µL y/o de 5-50µL 12 cubetas para espectrofotometría 12 puntas descartables respectivas PROCEDIMIENTO

 Solución azul de metileno 1mg/dL Pesar en la balanza analítica 1mg de azul de metilo. Mezclar 1mg/dL de azul de metileno previamente pesados en 100mL de agua destilada. Agitar hasta que se disuelva completamente.

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INT INTRO RO RODU DU DUCC CC CCIÓN IÓN Entre los diversos métodos de análisis de tipo cuantitativo que se utilizan para la determinación de moléculas o elementos constitutivos de los organismos se encuentra la espectrofotometría, que utiliza la medición de la intensidad de la luz transmitida y/o absorbida, a determinada longitud de onda, por compuestos químicos en solución. I.

Objetivos  Conocer el uso y aplicación del espectrofotómetro.  Aplicar la Ley de Lambert – Beer en el empleo del espectrofotómetro.  Determinar una curva de calibración, usando la solución de azul de metileno.

II.

Fundamento teórico El paso de un haz de luz de una longitud de onda determinada a través de una solución es reflejado en parte, mientras que la mayor fracción de esta es absorbida por la sustancia disuelta. La absorción es proporcional a la concentración del soluto. La propiedad de una sustancia para absorber radiación de una determinada longitud de onda es dependiente de su estructura química. La ley de Lambert y Beer expresa las relaciones antes mencionadas mediante la siguiente ecuación:

𝐿𝑜𝑔

9

𝐼𝑜 = 𝜀. 𝐼. 𝑐 𝐼𝑡

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Io

Luz incidente

It

Luz transmitida

ɛ

Coeficiente de extensión

I c

Distancia recorrida por la luz a través de la solución Concentración del absorbente

El log Io/It también se conoce como densidad óptica (D.O.) o absorbancia de la solución y es directamente proporcional a la concentración del soluto. Para determinar la concentración de una determinada sustancia puede hacerse uso del factor de calibración o de una curva de calibración. La preparación de una curva de calibración se realiza utilizando concentraciones conocidas de la sustancia cuya concentración deseamos conocer. Luego se determina la absorbancia de cada una de dichas concentraciones y se procede a preparar un gráfico, donde en el eje de abscisas se disponen las concentraciones de la sustancia y en el eje de ordenadas la absorbancia.  Factor de calibración Se define como la relación que existe entre la concentración del estándar y su respectiva absorbancia. Este factor puede obtenerse de la siguiente manera:

𝐹𝑎𝑐𝑡𝑜𝑟 𝑑𝑒 𝑐𝑎𝑙𝑖𝑏𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 =

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𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑑𝑒 𝑒𝑠𝑡á𝑛𝑑𝑎𝑟 𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎

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La concentración del estándar puede expresar como: mg/dL, µg/dL, mEq/L, U/L, etc. Para encontrar la concentración de una sustancia problema se multiplica el factor de calibración por la absorbancia del problema, operación que se realiza de acuerdo al siguiente procedimiento que se aplicará en el desarrollo del experimento. III.

Parte experimental  Preparación de una curva de calibración Para elaborar una curva de absorción se preparará el siguiente sistema: Solución de azul de metileno 1mg/dL

1mL

Agua destilada

4mL

Luego se procederá a realizar lecturas en el espectrofotómetro a las siguientes longitudes de onda: 560, 580, 600, 620, 640, 660, 680 y 700 nm. Graficar utilizando papel milimetrado las absorbancias en función de las longitudes de onda y determinar el pico de máxima absorción de azul de metileno, el cual corresponde al mayor valor de la absorbancia.

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Preparar el experimento de la siguiente manera: 1

2

3

4

5

mL Azul de metileno

0.5

1

2

3

4

mL Agua destilada

4.5

4

3

2

1

Llevar el espectrofotómetro a cero. Luego leer los tubos a una longitud de onda de 660 nm. Graficar en un papel milimetrado los resultados, disponiendo las concentraciones en el eje de abscisas en el eje de las ordenadas, luego trazar una recta a través de los puntos obtenidos experimentalmente. Utilizando la curva de calibración o el factor de calibración determinará la concentración de la sustancia problema en la presente práctica.

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PRÁCTICA 1 INFORME ESPECTROFOTOMETRÍA Apellidos

Nombres

N° Mesa

Fecha

INTRODUCCIÓN

OBJETIVOS

RESULTADOS

DISCUSIÓN

CONCLUSIONES

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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CAPÍTULO

2 FACTORES QUE AFECTAN LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

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PRÁCTICA N°2 FACTORES QUE AFECTAN LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA Determinación del efecto de la concentración del sustrato Logro de aprendizaje:

Determinación del efecto de la concentración de la enzima Determinación del efecto del pH sobre la actividad enzimática MATERIALES

I. MATERIALES EN LA MESA DE LOS ESTUDIANTES       

01 gradilla 17 tubos de ensayo 13x100mm 01 hígado de pollo (enzima fosfatasa ácida del hígado) 01 termómetro 01 piseta con agua destilada 02 pipetas graduadas o volumétricas 10mL 01 propipeta

II. REACTIVOS EN LA MESA DE LOS ESTUDIANTES   

01 albúmina a [1.3] absorbancia 450nm frasco 12mL 01 pepsina 2% frasco 3mL 01 buffer acetato 0.1M pH 3.6 frasco 5mL

III. MATERIALES EN LA MESA CENTRAL DEL PROFESOR   

01 baño maría 37°C o plancha de calentamiento 01 beaker 250 mL 01 termómetro PROCEDIMIENTO

 Buffer Acetato 0.1M pH 3.6 Para obtener soluciones de buffer acetato 0.1M de pH 3.6 se deberá preparar: Solución A (Acido acético 0.2M) medir 1,15 ml de ácido acético en una pipeta de 2 ml. Col...