Informe Practica 1 Inmunoprecipitación DE LA Cromatina PDF

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Profesor: Yolanda Aguilera...

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EPD 1 INMUNOPRECIPITACIÓN DE LA CROMATINA Javier García Botello

1. Describe brevemente el fundamento teórico de la técnica ChIP. 

El objetivo de esta técnica es conocer qué factores de transcripción controlan la expresión génica en distintas condiciones. Para ello se trata de observar a qué regiones de DNA y en qué condiciones se une un factor de transcripción. La técnica se basa en fijar la célula en una determinada condición experimental (i.e estrés, indiferenciación…), provocando que las uniones proteína-DNA se mantengan intactas en las etapas posteriores. Prácticamente es como se si se tomase una fotografía de la célula en dichas condiciones. Para observar la región en la que se ha unido la proteína es necesario purificar el fragmento de DNA. Esto se hace mediante el uso de un anticuerpo dirigido al factor de transcripción en cuestión, con lo que se rescata el complejo proteína-DNA. A su vez, se utilizan bolitas de agarosa con proteína A que se unen al anticuerpo para rescatar el complejo anticuerpo – antígeno/proteína – DNA. Tras un tratamiento para eliminar la unión del DNA a las bolas y a la proteína, éste queda completamente purificado y es amplificado para conocer la secuencia.

2. Enumera brevemente los pasos a seguir en la técnica ChIP. 

1. Fijar las células con formaldehído. 2. Lisar las células. 3. Sonicar para fragmentar el DNA y aumentar la eficiencia de la técnica. 4. Centrifugar para eliminar los restos celulares más grandes. 5. Separar la muestra en dos para obtener el control del Input. 6. En la fracción reservada para seguir con el protocolo, se añaden bolitas de agarosa (con proteína A/G y esperma de salmón) para realizar un pre-aclarado de la muestra. Centrifugar y descartar las bolas, mantener sobrenadante. 7. Inmunoprecipitación de cromatina: Incubar con anticuerpo dirigido contra el factor de transcripción estudiado. 8. Purificación del inmunocomplejo: Añadir de nuevo bolitas de agarosa. Centrifugar y quedarse con las bolas. 9. Lavados en concentraciones crecientes de sal y TE buffer. 10. Separar el inmunocomplejo de las bolitas de agarosa: Añadir elution buffer.

11. Reverse crosslink: Aumentar la temperatura para eliminar la unión proteínaDNA. 12. Degradación de proteínas mediante proteasas. 13. Purificación de DNA. 14. PCR

3. ¿Qué es input? 

Los datos obtenidos por la técnica de ChIP necesitan ser normalizados debido a temas de variabilidad, incluyendo cantidad de cromatina, eficiencia de la inmunoprecipitación y otros aspectos. El Input o control de carga es un experimento que nos permite saber la cantidad de cromatina de la que se ha partido en cada condición experimental, para más tarde normalizar los resultados.

4. ¿Por qué son importantes los pasos de pre-aclarado de la muestra y el control con IgG? 

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Pre-aclarado: Este paso se realiza para aumentar la eficiencia de la técnica y eliminar ruido en los resultados. El uso de las bolas de agarosa antes de añadir el anticuerpo de interés limpia la muestra de posibles uniones inespecíficas que podrían darse en el paso posterior. Es decir, todo aquello que podría interferir se une ya a las bolas por medio de la proteína A o el esperma de salmón y se elimina tras la centrifugación. De esta forma, al añadir más tarde el anticuerpo y nuevas bolas, la muestra es mucho más limpia y el número de uniones inespecíficas disminuye considerablemente. Control con IgG: Es un control negativo que se utiliza en la mayoría de los experimentos que involucran anticuerpos. Permite saber si la unión entre tu anticuerpo de interés (aquí anti-p53) y su epítopo (proteína p53) es una unión específica. Si se observa señal en este control, quiere decir que la unión anticuerpo-epítopo no es específica y los resultados obtenidos no son fiables.

5. Describe brevemente los pasos a seguir para el diseño de primers en ChIP-PCR. Estudiar en la bibliografía si se han descrito previamente primers para esta tarea. Si no, se busca información sobre el factor de transcripción en cuestión, la región del DNA a la que se une, etc. Es importante que una vez diseñados los primers se verifique que detectan al gen de interés. Esto se hace bioinformáticamente mediante BLAST.

Comentar los resultados 

Se observó la interacción de la proteína p53 con el promotor del gen Nanog en 4 condiciones experimentales: +LIF, -DETA-NO

+LIF, +DETA-NO

-LIF, -DETA-NO

-LIF, +DETA-NO

Según los resultados, p53 interacciona con Nanog sólo en la última condición: -LIF, +DETA-NO. Esta condición es de diferenciación celular, en la que las células carecen de la citoquina LIF y están sometidas a estrés oxidativo debido al NO. Este resultado es consistente con la bibliografía, que sugiere que el estrés activa la expresión de p53 que interacciona y reprime el promotor de Nanog, promoviendo la diferenciación celular. En el resto de condiciones se observan los resultados esperados: +LIF, -DETA-NO & +LIF, +DETA-NO  La presencia de la citoquina LIF es suficiente para mantener a la célula en estado indiferenciado, y p53 no reprime Nanog ni aún en condiciones de estrés. -LIF, -DETA-NO  Al no haber condición de estrés, p53 no se expresa y no reprime Nanog.

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Protein A and G are popular choices for antibody purification, because they are both stable and target selective. IgG class antibodies from multiple species bind to protein A and/or G, allowing antibody to be captured on protein-bound beads. Protein A and G bind IgG subtypes with varying affinities, determined by species and the properties of the heavy chain. Protein A is a 42 kDa surface protein originally found in the cell wall of the bacteria Staphylococcus aureus. It has found use in biochemical research because of its ability to bind immunoglobulins. It is composed of five homologous Ig-binding domains that fold into a three-helix bundle. Each domain is able to bind proteins from many mammalian species, most notably IgGs. It binds the heavy chain within the Fc region of most immunoglobulins. Through these interactions in serum, where IgG molecules are bound in the

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wrong orientation (in relation to normal antibody function), the bacteria disrupts opsonization and phagocytosis. Chromatographic separation using protein A immobilized on porous substrates is the most widely established method for purifying monoclonal antibodies (mAbs) from harvest cell culture supernatant.[18] The choice of protein A as the preferred method is due to the high purity and yield which are achieved in a single unit operation, coupled with the fact that protein A chromatography forms the basis for a purification "platform" which simplifies manufacturing operations and reduces the time and effort required to develop purification processes.[19] A typical mAb purification process is shown at right. It is important to understand interactions of the antibody with its antigen. The immunoglobulin G (IgG) is the most common antibody type used in immunocytochemistry. The antibody structure (Fig. 1) consists of the variable region (Fab portion) of the antibody that binds the epitope part of the antigen and the constant region (the Fc portion) that is specific to the animal where the antibody was raised. Thus, a rabbit anti-tubulin antibody was made in a rabbit and binds the protein tubulin, and it can, in turn, be bound on its constant region by an antibody to rabbit IgG. In this example, the antibody that binds the antigen of interest is referred to as the primary antibody, and the antibody that binds the Fc portion of the primary antibody is known as a secondary antibody. An immunoglobulin G (IgG) antibody is a single protein made from four peptides joined by disulfide bonds. There is a single constant region (white) containing the Fc portion and species-specific antigens. The variable region (gray) contains the Fab portion ... A ver entonces la IgG de rabbit se uniría a las bolas de agarosa, concretamente a la proteína A. La proteína A no es más que un modo de “pescar” anticuerpos de la familia IgG. El anti-p53 también es de la familia de IgG. Lo pesca por la cadena pesada, es decir la parte no específica del anticuerpo. En el experimento con anti-p53 la bola con su proteína A pesca al anti-p53, que estará unido a p53 y a su vez al fragmento de DNA. Posteriormente observaríamos una banda en el gel (los primers están hechos para amplificar promotor de nanog). En cambio, en el experimento con IgG a secas, una proteína IgG básica, que no tiene especificidad por nada en particular, se une también a la bolita por la proteína A, pero en este caso la IgG no debería estar unida a nada más, a ninguna proteína más y por tanto a ningún DNA, y en el posterior gel no hay banda. Es una forma de ver que la bola de por sí y el IgG básico no se están uniendo a otras proteínas (concretamente a p53) de forma inespecífica. De esta forma estamos seguro de que lo que nos ha salido en el experimento con anti-p53 es realmente pq se ha unido a p53. Si hubiese una banda en el exp del IgG, significaría que el IgG también se une a p53 y esto

quiere decir que el IgG se une inespecíficamente al epitopo de p53, y si lo ha hecho con esta proteína, tb puede haberlo hecho con otras, por lo que no estamos seguros de que nuestro anti-p53 solo haya “pescado” proteínas p53. Si ha pescado otra proteína que no tiene na que ver, estaríamos viendo resultados falsos.  Primer design for this task http://fg.cns.utexas.edu/fg/protocol__ChIPDNA_primer_design.html...