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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS CARRERA DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Y AMBIENTALES BIOLOGÍA MOLECULAR Extracción de ADN vegetal y Electroforesis en gel de agarosa Camilo Andrés Rosero-Gómez Quinto Semestre- Paralelo 2 - 20/07/2018 Resumen En la actualidad son innumerables l...

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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS CARRERA DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Y AMBIENTALES BIOLOGÍA MOLECULAR

Extracción de ADN vegetal y Electroforesis en gel de agarosa Camilo Andrés Rosero-Gómez Quinto Semestre- Paralelo 2 - 20/07/2018

Resumen En la actualidad son innumerables los análisis e investigaciones que trabajan con ADN, aplicando marcadores moleculares y secuenciación para analizar los genes. Los procedimientos requieren de reactivos y técnicas específicas que están en constante evolución con la finalidad de obtener mejores resultados tanto cuantitativa como cualitativamente. Este estudio se planteó extraer ADN de muestras vegetales para luego ser analizado mediante una electroforesis en gel de agarosa al 1.5%. Para lograr lo anterior se aplicó la metodología recomendada en la literatura tanto para la preservación de las muestras vegetales como para la extracción del ADN. Para el análisis de calidad y cantidad se utilizó un espectrofotómetro NANODROP-1000 y para fotodocumentación del gel de la electroforesis un sistema Chemidoc™ MP con Image Lab™ facilitado por el Laboratorio de Biotecnología Vegetal de la Universidad Central del Ecuador. Se obtuvo un 100% de pureza y un 85% de muestras libres de contaminantes entre las analizadas, registrando todas una concentración adecuada de ADN con A. macracantha sobrepasando los 9000 ng/µl. Se concluyó que ciertas muestras muy fragmentadas son debido al proceso de extracción mecánica y se recomienda realizarlo con enzimas específicas así tome más tiempo. Palabras clave: Extracción ADN, electroforesis, CTAB, fotodocumentación, A. macracantha, S. melongena.

Introducción La obtención de ADN de buena calidad para la realización de procedimientos moleculares es vital para el éxito de cualquier proyecto de identificación de especies vegetales, o para su simple caracterización y aporte a la base de datos mundial conocida como “BARCODE” (Cadavid-Sánchez et al. 2013). El paso inicial de la extracción del ADN vegetal es muy importante pues según Solano-Flórez y colaboradores (2009) algunos de los principales factores que afectan a perfiles de amplificación, son justamente la calidad, pureza y cantidad del ADN extraído de las muestras disponibles. Uno de los principales inconvenientes técnicos en la purificación de ADN vegetal se da por la obtención de fenoles y polisacáridos en conjunto con el material genético lo que disminuye su cantidad y calidad (Molinari y Crochemore 2001; Orozco-Gutiérrez et al. 2010).

La inclusión del detergente catiónico (CTAB) para la extracción en lugar del dodecilsulfato de sodio (SDS) redujo el tiempo empleado al trabajar con muestras vegetales debido a su cualidad de precipitar los ácidos nucleicos como sales insolubles, reduciendo así la aparición de polisacáridos y proteínas contaminantes que aumentaban la posibilidad de degradación del material genómico (Reyes-Martínez et al. 2011). El ADN extraído de un tejido debe ser cuantificado y el método más empleado para la determinación de estas características es la electroforesis en gel de agarosa (Padilla-Peña 2005). Esta técnica es comúnmente empleada para separar fragmentos de moléculas de ácidos nucleicos, cuyo principio se basa en la migración de las moléculas, por acción de un campo eléctrico, a través de un medio gelatinoso, mezclado con bromuro de etidio que ayuda a fluorescer (Rocha-Salavarrieta 2002). Con la finalidad de poner en práctica los conocimientos teóricos adquiridos acerca de las técnicas moleculares, en el presente trabajo se plantearon los siguientes objetivos: 1. Extraer y cuantificar ADN de muestras vegetales; 2. Realizar una electroforesis en gel de agarosa al 1.5%, del ADN genómico extraído previamente y analizar los resultados.

Materiales y Métodos Para la extracción y cuantificación de ADN: Material vegetal preservado en Silica gel Mortero Buffer de extracción (CTAB) Tubos Eppendorf Microcentrífuga Micropipetas y puntas de plástico Buffer TE Cloroformo alcohol isoamílico (24:1, v/v) Baño María Isopropanol frío Etanol 70% Espectrofotómetro (NANODROP-1000) Para la electroforesis en gel de Agarosa Cámara de electroforesis TBE 1X SYBR Safe Fotodocumentador Chemidoc™ MP con Image Lab™ Microondas

Botella medio Blue juice Ladder 100 – 1000 bp

Empezando con la extracción del ADN, se pusieron 3 hojas de naranjilla en un mortero junto con 800 µl de buffer de extracción (CTAB). Estas fueron trituradas lo más finamente posible y luego puesto lo obtenido en un tubo Eppendorf a Baño María a 62°C por 20 minutos. Al resultado se le agrega 500 µl de la mezcla cloroformo: alcohol isoamílico (24:1) y se agita vigorosamente hasta observarse un aspecto lechoso. Se procede a poner en la microcentrífuga a 13000 rpm por 10 minutos para separar la fase más densa (proteínas, lípidos) de la más liviana (material genético) (Nieto et al. 2005). Con ayuda de una micropipeta cuidadosamente se separó el sobrenadante y se depositó en un tubo Eppendorf limpio. Se le agregó la misma cantidad de isopropanol frío el cual después de ser mezclado va a compilar el ADN pues es insoluble en este, observándose finas fibras blanquecinas. Se eliminaron los residuos y se lavó con etanol al 70%. Finalmente la muestra fue conservada con 50 µl de TE, que evita la acción de nucleasas, y guardada en refrigeración para futuros análisis. Para la cuantificación del ADN se utilizó un espectrofotómetro NANODROP-1000. Con la finalidad de analizar el ADN extraído se preparó u gel de agarosa para la electroforesis. Primero se debe armar la cama del gel, poner el peine y sellar con cinta masking los soportes plásticos. Se pesan 0.4 g de agarosa y se transfieren a un Erlenmeyer junto con 40 ml buffer TBE 1X para que se disuelvan con ayuda del calor de un microondas (Schmiderer et al. 2013). Mientras se enfría un poco el gel ya homogéneo se colocó buffer TBE 1X en la cámara de electroforesis, suficiente para cubrir el gel. Acto seguido se añadió 4 µl de SYBR Safe, que permitió observar el ADN disperso por el gel, vertiéndolo sobre el molde. Se espera unos 30 minutos a que solidifique para poder retirar el peine y llevar a la cámara de electroforesis. Para finalizar con el procedimiento se agregó 3 µl de muestra de ADN con 1 µl de blue juice para evitar que se mezcle con el medio y darle una densidad que lo lleve al fondo del pocillo. En la primera ranura del gel se puso el ladder y seguidamente cada una de las muestras a analizar. Se dejó correr la electroforesis a una corriente de 110 V por 30 minutos. Cuando transcurrió el tiempo se retiró del marco de electroforesis para llevarlo al fotodocumentador que conectado a la computadora proceso los resultados finales.

Resultados Se analizó una por una la calidad del ADN extraído de las muestras vegetales con ayuda del espectrofotómetro NANODROP-1000 del Laboratorio de Biotecnología Vegetal de la Universidad Central del Ecuador. Los resultados se presentan en la tabla 1.

Tabla 1. Resultados del análisis de la calidad del ADN en el espectrofotómetro. Pocillo Especie Concentración (ng/µl) Pureza (A260/A280) Contaminantes

2 3 A. Z. macracantha longifolia

4 S. nigra

5 6 S. S. melongena quitoense

7 S. nigra

8 S. melongena

9290.8

8702.1

1865.7

7301.2

1804

1256.6

6386.6

2.02

2.03

2.07

2.10

2.07

2.07

2.06

1.97

2.16

2.18

2.15

2.13

2.22

1.47

En general en todas las muestras analizadas arrojaron una pureza sobre el estándar (>1.80). En cuanto a la concentración de ADN se presentaron valores bastante altos en la mayoría de las muestras, solo en las hojas de tilo ( S. nigra) y naranjilla (S. quitoense) arrojaron valores bajo los 2000 ng/µl. En el análisis de los posibles remanentes de contaminación en las muestras, únicamente fue la ubicada en el pocillo #8 (S. melongena) cuyo valor no superó el estándar (>1.90) (fig. 1).

Fig. 1. Resultados de los análisis de cantidad y calidad de las muestras de ADN en el espectrofotómetro NANODROP-1000. En cuanto a la electroforesis realizada en gel de agarosa se obtuvo la fotografía procesada del equipo de fotodocumentación de geles (fig. 2) en la cual se observa al primer carril (izquierda) que lleva el ladder marcando desde 100 a 1000 pares de bases. Hacia la derecha de este y hasta el carril 8 se encuentran las muestras vegetales analizadas de cada grupo de trabajo.

LD

2

3

4

5

6

7

8

Fig. 2. Fotografía del gel como resultado de la fotodocumentación en Image Lab™ donde se evidencian las bandas de ADN genómico vegetal. Las muestras de los carriles 5 y 8 más brillantes corresponden a S. melongena (berenjena) mientras que las más claras se aprecian en los carriles 4 y 7 y son del ADN extraído de S. nigra (tilo). El ladder en el lado izquierdo indica que los restos que más avanzaron en los 30 minutos que corrió el gel, son las fibras más fragmentadas del ADN almacenado que llegarían a tener menos de 100 pares de bases. Discusión Al ser la mayoría de las muestras recolectadas de hojas jóvenes de los ejemplares en campo, concuerda con lo expresado por Quiala y colaboradores (2008) que avalan el uso de tejidos jóvenes o poco diferenciados, por su mayor abundancia de células/masa fresca y por contener una menor proporción de polisacáridos y polifenoles, resultando así en un mayor rendimiento del ADN purificado. En la metodología de extracción es bueno resaltar el uso del detergente CTAB que es el más utilizado y eficiente para extraer el ADN de especies vegetales cuando se cuenta con pequeñas muestras de tejido (Reyes-Martínez et al. 2011). Los análisis cuantitativos arrojaron un 100% de pureza y un 85% de muestras libres de contaminantes entre las analizadas, únicamente resaltando la correspondiente al pocillo #8 de la cual se dedujo su valor de 1.47 era debido a la presencia de restos de etanol, del lavado previo a la obtención del pellet de ADN definitivo.

Además se puede afirmar que todas las muestras obtenidas registran una concentración adecuada de ADN resaltando la de A. macracantha que sobrepasa los 9000 ng/µl siendo un muy buen remanente de concentración con el cual se puede trabajar en el futuro previo procesos de conservación en congelador (Solano-Flórez et al. 2009). En la fig. 2 se observa cómo el ADN aun puro se encuentra en la parte de arriba de la fotografía muy cerca a los pocillos, mientras que las bandas más grandes en la parte inferior son fragmentos de material genético muy degradados. Esto pudo deberse a excesos en la destrucción mecánica de las membranas que afectó también al material objetivo, contrastando así con estudios previos que sugieren que el tipo de tejido tiene más relevancia en la pureza del material genético que el método de extracción que casi no influye en la pureza del ADN obtenido (Solano-Flórez et al. 2009) Estos inconvenientes que se presentan al trabajar con plantas se deben principalmente a la composición de su pared celular, que dificulta el acceso al núcleo para la extracción del material genético. Velasco-Mosquera y colaboradores (2005) recomiendan la técnica doble, usando acción mecánica al pulverizar el tejido con nitrógeno líquido, sumado a una degradación enzimática de las membranas liberando así los compuestos disponibles dentro de las células. Las bandas más brillantes en la fig. 2 corresponden al ADN de S. melongena (berenjena) una planta que si bien puede ser difícil de manejar por la cantidad de taninos y polifenoles (Arévalo-Benites et al. 2014) marca un claro contraste en la fotografía UV resaltando por sobre las demás muestras con sus altos niveles de fragmentos de material genético.

Conclusiones y Recomendaciones La obtención de ADN genómico de muestras vegetales requiere de procedimientos muy precisos que se deben seguir a la perfección, para evitar obtener muestras de mala calidad que arrojen resultados indeseados en la electroforesis. La calidad y cantidad de la muestra vegetal, así como las características fisicoquímicas dependiente de la especie estudiada, influirán en la concentración y pureza del extracto final, el cual debe ser preservado en buffer TE si se quiere utilizar a futuro. Se recomienda para nuevos procesos de extracción de ADN vegetal, usar el método de lisis de membranas por enzimas específicas para evitar daño en demasía al material genético con el método mecánico tradicional. Referencias Bibliográficas

Arévalo-Benites G, Boncún-León B, Ruiz-Reyes G, Soto-Vásquez M y VenegasCasanova E. 2014. Estudio fitoquímico y efectos sedativo e hipnótico de Solanum melongena var. esculentum (Dunal) Nees en Cavia porcellus en comparación con Diazepam. Revista Pharmaciencia, 2 (2): 56-63.

Cadavid-Sánchez IC, Rosero-García DA y Uribe-Soto SI. 2013. Comparison of two ADN extraction methods from plants belonging Solanum genus Leptostemonum subgenus. Rev. Colomb. Biotecnol, 15(2): 186-192. Molinari HB y Crochemore ML. 2001. Genomic DNA Extraction from Passiflora spp. for PCR-RAPD Analyses. Rev. Bras. Frutic., Jaboticabal, 23(2): 447-450. Nieto JE, Ramos L y Motte E. 2005. Extracción y Purificación de ADN de Tectona grandis L. para su empleo en la técnica RAPD. Foresta Veracruzana, 7(2): 1-6. Orozco-Gutiérrez G, Díaz R, González-Chavira M, Muñoz-Flores HJ, Coria-Avalos VM y García Magaña J. 2010. DNA extraction and a test of primers in Pinus pseudostrobus Lindl. for AFLP markers. Foresta Veracruzana, 12(2): 15-20. Padilla-Peña CA, Diez-Dapena J, Martínez E, Bárcena-Ruiz JA y García C. 2005. 17.Electroforesis de ácidos nucleicos en geles de agarosa. Aislamiento y caracterización electroforética de DNA plasmídico. Departamento de Bioquímica y Biología Molecular. Universidad de Córdoba. Quiala E, Valledor L, Hazbun R, Barbón R, De Feria M, Chávez M y Rodríguez R. 2008. Estandarización de un protocolo de obtención de ADN genómico para la cuantificación de 5mC en brotes epicórmicos de Tectona grandis L. Biotecnología Vegetal, 8(1): 51-56. Reyes-Martínez A, Barriada-Bernal LG, Rivera-Rodríguez DM, Pajarito-Ravelero A, Delgado-Alvarado EA, Almaraz-Abarca N, Herrera-Corral J, Uribe-Soto JN y Naranjo-Jiménez N. 2011. Comparación de dos métodos para obtener ADN total de Phaseolus vulgaris para análisis de ISTR. Vidsupra, 3(1): 23-29. Rocha-Salavarrieta PJ. 2002. Theory and Practice for the Purification of the Oil Palm DNA. Palmas, 23(3): 9-16.

Extraction

and

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