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Laboratorio de Microbiología de Alimentos Clave. 1619 Practica 3. Determinación de Staphylococcus aureus en alimentos Equipo 2. Resumen. En esta práctica se realizó el análisis de un alimento de origen lácteo para determinar y aislar S. aureus enterotoxigénico por medio de metodología tradicional qu...

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Laboratorio de Microbiología de Alimentos Clave. 1619

Practica 3. Determinación de Staphylococcus aureus en alimentos

Equipo 2.

Resumen. En esta práctica se realizó el análisis de un alimento de origen lácteo para determinar y aislar S. aureus enterotoxigénico por medio de metodología tradicional que se apega a la NOM. Objetivos. ❖ Identificar según el método planteado en las NOM (NOM-115-SSA1-1994, NOM242-SSA1-2009 y NOM-243-SSA1-2010) para comprender y explicar cada etapa de análisis, desde el aislamiento hasta la caracterización de S. aureus en un alimento. ❖ Reflexionar sobre el impacto que tiene la presencia de S. aureus enterotoxigénico en la calidad de los alimentos y las consecuencias para la salud, de modo que a partir del mecanismo de patogenicidad se logren conocer técnicas de prevención y tratamiento. ❖ Conocer las características morfocoloniales de Staphylococcus aureus en Agar Baird Parker; así como sus características microscópicas y características específicas para S. aureus enterotoxigénico. ❖ Conocer y aplicar la metodología establecida para determinar y cuantificar la presencia de Staphylococcus aureus en alimentos frescos y/o procesados.

❖ Verificar si el alimento cumple con la Norma oficial Mexicana.

Diagrama de flujo

Etiqueta del alimento

Resultados. Muestra: 10 g de Crema: ●

Aislamiento selectivo:

Tabla 1. Conteo de colonias sospechosas para Staphylococcus aureus en medio Baird Parker a las 48 horas a 35±2°C. Numero de colonias características (centro negro con halo) Dilución en caja

Serie 1

Serie 2

-2

>150

>150

10

-3

>150

>150

10-4

>150

>150

10-5

40

45

10

● Recuperación de la cepa A partir de las cajas de dilución 10-5, se seleccionaron 3 colonias de cada caja para inocular en 3 tubos de caldo BHI. -Identificación microscópica: Cocos de tamaño mediano, gram + y agrupados en racimos o pares. ●

Identificación bioquímica

Tabla 2. Resultados de pruebas bioquímicas de las colonias seleccionadas tomadas de la Dilución 10-5 Pruebas bioquímicas Cultivo

Catalasa

Mannitol

Coagulasa*

Termonucleasa*

1

+

+

+

+

2

+

+

+

+

3

+

-

+

+

*Pruebas definitivas para la identificación de S.aureus enterotoxigénico según la NOM-115-SSA1-1994.

Cálculos Las cajas Petri representativas estadísticamente, contenían 43 UFC sospechosas. Éstas se localizaban en la caja Petri sembrada con la dilución 10-4 (0.0001g/mL). Se tomaron 3 colonias para caracterizarlas bioquímicamente. Promedio de colonias: 42.5= 43 Tomando en cuenta la dilución 43x10 4 De las tres colonias probadas 43x104 - 100% X - 66.6% x= 29 x104 UFC/g Análisis y discusión de resultados. S. aueus son cocos anaerobios facultativos, Gram positivos y se presentan en pares o racimos, no son móviles, ni esporulados; algunos biotipos son capaces de producir una toxina altamente termoestable, así por ejemplo, Staphylococcus aureus produce 5 toxinas, que pueden provocar severas intoxicaciones en el hombre (3). Las tres condiciones necesarias para el óptimo desarrollo de Staphylococcus aureus son: pH cercano a la neutralidad, temperatura alrededor de 30ºC y ausencia de microorganismos competitivos. Este último punto es importante, ya que Staphylococcus aureus no es competitivo en presencia de otros microorganismos (3). La cantidad de Staphylococcus aureus necesaria para producir suficiente toxina (1.0 microgramo), para causar intoxicación, es de 106 UFC/g de alimento de acuerdo con la Norma Oficial Mexicana (NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-115-SSA1-1994, BIENES Y SERVICIOS. MÉTODO PARA LA DETERMINACIÓN DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS EN ALIMENTOS.)(7), sin embargo Jablonski et. al., comentan que el FDA, establece que una cantidad de Staphylococcus aureus patógeno, en el que se encuentren 105 UFC/g de alimento, provoca intoxicaciones y que un nivel basal de aproximadamente un nanogramo de toxina estafilocóccica por gramo de alimento, es suficiente para causar síntomas asociados con la intoxicación. Comunicaciones internacionales coinciden en que la enterotoxina A es la más prevalente en las cepas de Staphylococcus aureus de origen humano y por tanto también en productos que

requieren manipulación y están listos para su consumo. La contaminación de alimentos por S. aureus, produce gastroenteritis que se manifiesta por un cuadro caracterizado por vómitos y diarrea (1). Staphylococcus coagulasa positivo se encuentra entre los diez patógenos causales de ETA (enfermedades transmitidas por alimentos) más implicado en salud pública a nivel mundial. Los alimentos que requieren considerable manipulación durante la preparación y que se mantienen a temperatura ligeramente elevada después de ésta, frecuentemente están involucrados con la presencia de Staphylococcus coagulasa positivo o su enterotoxina como es el caso de la muestra de crema.(2). Su metabolismo es oxidativo/fermentativo, es catalasa positivo y puede metabolizar una gran variedad de carbohidratos en condiciones aeróbicas, con la subsecuente liberación de ácido, principalmente ácido acético con pequeñas cantidades de dióxido de carbono; en condiciones anaerobias, el producto principal de la fermentación es el ácido láctico, es capaz de fermentar el manitol en condiciones de anaerobiosis(3). En el aislamiento selectivo de Staphylococcus aureus , se utiliza un medio selectivo sólido, el cual inhibe el desarrollo de géneros diferentes al Staphylococcus, pero además permite reconocer el desarrollo característico del microorganismo buscado, en este caso se empleó agar Baird Parker, el cual es un medio selectivo por la presencia de glicina, cloruro de litio y telurito potásico. A partir de las cajas de agar Baird-Parker, se identificaron las posibles colonias de S.aureus debido al color negro característico, que evidencia la capacidad de S. aureus de reducir el telurito de potasio a telurio metálico debido a la actividad de la enzima telurito reductasa, sin embargo, esta característica también se puede observar en S. epidermidis, por lo que para seleccionar las colonias sospechosas se tuvo en cuenta también otro factor. Las lecitinas (componentes de la yema de huevo) pueden ser hidrolizadas por lecitinasas, esta hidrólisis genera ácidos fosfóricos y colina, los cuales forman halos transparentes alrededor de una colonia negra(3). Estas son las características morfológicas principales de las colonias de Staphylococcus aureus y a partir de estas se realizó el conteo y la posterior tinción de gram para la confirmación de las características microscópicas de Staphylococcus aureus. El conteo de las colonias características de Staphylococcus aureus se realizó posterior a 48 horas de incubación a 35±2 ºC. En este se observó crecimiento en todas las diluciones inoculadas, pero el estadísticamente representativo fue la dilución 10-5 con 45 colonias negras grandes, circulares, brillantes, convexas con halo claro alrededor y 40 colonias chicas negras brillantes circulares, convexas con halo claro alrededor de la colonia. . Se eligieron 3 colonias con las características específicas, a las cuales se les realizó tinción de gram. Las observaciones después de la tinción de gram, confirmaron que se trataba de cocos gram positivos agrupados en racimos, por lo que a partir de estas colonias se realizó la recuperación de la cepa, este paso permite restaurar las células dañadas de Staphylococcus

aureus. Para esto se utilizó caldo BHI/infusión cerebro corazón, medio de cultivo de enriquecimiento ideal para microorganismos con requerimientos nutricionales exigentes.(3)

Finalmente la Identificación bioquímica, nos permite identificar el género y especie de Staphylococcus aureus enterotoxigénico. Se realizaron las pruebas de presencia de las enzimas: coagulasa, catalasa y termonucleasa. La prueba de presencia de la enzima catalasa se utiliza para probar la capacidad del microorganismo para producir la enzima catalasa, la cual facilita la conversión de peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno, siendo de utilidad para evitar la formación de radicales tóxicos por el sistema de la mieloperoxidasa en las células fagocíticas (8). La prueba es positiva cuando la bacteria reacciona produciendo la liberación de burbujas, que es la característica dada por la descomposición del peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno (8). Para los 3 cultivos se obtuvo un resultado positivo para la prueba de la catalasa al observar un burbujeo cuando se le agregó el revelador a la muestra. En el caso de la coagulasa, esta prueba es positiva si hay presencia de un coágulo, de lo contrario se toma como negativa. Las coagulasas, que son tanto la coagulasa libre como el llamado “clumping factor” actúan cubriendo a la célula de fibrina y por tanto haciéndola más resistente a la opsonización y fagocitosis. Siendo así un determinante de patogenicidad de Staphylococcus aureus (4). La coagulasa es un factor de agregación y constituye una prueba muy sensible y específica para esta bacteria. Esta proteína representa un importante factor de virulencia (8). La coagulasa puede unirse al fibrinógeno y convertirlo en fibrina insoluble, la cual tiende a formar depósitos donde los estafilococos pueden agregarse (8). Esta prueba se determinó positiva en todos los casos al observar las muestras después de 6 hrs de incubación. La termonucleasa, es una enzima termoestable que degrada al ácido desoxirribonucléico 0h0asta nucleótido (5). Para determinar la presencia de esta enzima se hacen orificios circulares en el agar DNA y se coloca una gota de la suspensión bacteriana que creció en caldo infusión cerebro corazón previamente calentada durante 15 minutos en baño de agua hirviendo. Esta prueba resulta positiva cuando hay formación de un color rosa brillante extendido por lo menos un milímetro alrededor del orificio, en donde se inoculó. Este color rosa se debe a el indicador de orto toluidina. Staphylococcus aureus se caracteriza por ser termonucleasa positivo. Se utiliza como una prueba indirecta de la presencia de grandes cantidades de Staphylococcus aureus en los alimentos, así como de la posible formación de enterotoxina estafilocócica. La producción de esta enzima se inhibe en anaerobiosis y se estimula por la presencia de oxígeno, requiere iones calcio para su actividad enzimática, posee un pH óptimo de 8,6 y se precipita de cultivos fluidos con sulfato de amonio. Su termoestabilidad (resiste temperatura de 130 ºC por 16,6 min) es la única asociación con el crecimiento de S. aureus. (6). De igual manera se obtuvo un resultado positivo en esta prueba.

La prueba de fermentación de manitol en anaerobiosis, se realizó a partir de la suspensión del microorganismo desarrollado en el medio infusión cerebro corazón, inoculándolo en cada tubo de caldo manitol,con aceite mineral estéril. Después de su incubación de 24 horas a 35±2 ºC, se observó desarrollo y un vire del indicador, dando la prueba positiva. El caldo manitol tiene rojo de fenol, el cual es un indicador de pH, que caracteriza la producción de ácido, producto de la fermentación y hace que haya un vire a color amarillo. En este casol, dos de los cultivos fueron positivos ya que se dio el vire a amarillo debido a la fermentación del manitol en condiciones de anaerobiosis. Por otra parte, el tercer cultivo resultó negativo, esto pudo deberse a que el inóculo no tenía una concentración lo suficientemente grande para fermentar todo el carbohidrato o a que comenzó a utilizar las peptonas alcalinizando el medio.

Conclusiones Presencia crema.

29x104 UFC/g

de Staphylococcus aureus enterotoxigénico en 10 g de

De acuerdo con lo que dicta la Norma Oficial Mexicana, el alimento se encuentra escasamente dentro de las especificaciones, sin embargo en la legislación estadounidense de acuerdo con lo que estipula la FDA (Jablonski, 2001) presentan riesgo para la salud pública; por lo que no se debe consumir. Bibliografía 1. Vanegas, M, González, L, Martínez & A, Buitrago, F. (2008). Aislamiento y caracterización de cepas de Staphylococcus enterotoxigénicos aislados en quesos en Bogotá. Rev.MVZ Cordoba vol.13 no.2 Córdoba May/Aug. 2008 2. Matamoros PRDM: Estafilococo coagulasa positivo en alimentos analizados en el laboratorio de salud pública de junio de 2000 a junio de 2001. Secretaria distrital de salud de Bogotá, laboratorio de salud pública; 2007. 3. CAMACHO CRUZ, Alejandro, GILES GÓMEZ, Martha, ORTEGÓN ÁVILA, Aurora, PALAO RINCÓN, Mercedes, SERRANO LÓPEZ, Beatriz, VELÁZQUEZ MADRAZO, Olga. (2009) TÉCNICAS PARA EL ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE ALIMENTOS. Segunda Edición. México. pp 4. V. Seija. Temas de Bacteriología y Virología médica. Consultado el 10 de abril de 2016 de la página: http://www.higiene.edu.uy/cefa/2008/Staphylococcus.pdf 5. CONTROL MICROBIOLÓGICO DE LOS ALIMENTOS. STAPHYLOCOCCUS AUREUS. RECUENTO EN PLACA DE SIEMBRA POR EXTENSIÓN EN SUPERFICIE.

(Primera Edición). Consultado el 10 de abril de 2016 de la página: https://law.resource.org/pub/ec/ibr/ec.nte.1529.14.1998.pdf 6. Lombard Armando, Castillo Virginia, Ortiz César. Detección de la desoxirribonucleasa termoestable (termonucleasa) directamente en el alimento. Instituto de Nutrición e Higiene de los Alimentos. Consultado el 10 de abril de 2016 de la página: http://bvs.sld.cu/revistas/ali/vol10_2_96/ali05296.htm 7. NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-115-SSA1-1994, BIENES Y SERVICIOS. MÉTODO PARA LA DETERMINACIÓN DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS EN ALIMENTOS.Consultada el 10 de abril del 2016 en : http://www.salud.gob.mx/unidades/cdi/nom/115ssa14.html 8. MacFaddin JF. Pruebas bioquímicas para la identificación de bacterias de importancia clínica, 3era edición. Editorial Médica Panamericana. Buenos Aires, Argentina. 2003....