Staph Aureus - informe PDF

Preview

Summary

Informe laboratorio desconocido - staph aureus ...

Description

JRL Abstracto

Identificación del desconocido utilizando la prueba de API Staph MSR

Staphylococcus xylosus es una bacteria Gram positiva que pertenece a la familia Staphylococcaceae. Es un componente de suma importancia en la carne. Para poder identificarlo, se llevó a cabo este experimento donde se realizaron pruebas en API Staph al igual que pruebas de catalasa, coagulasa con plasma de conejo y agar de sangre para identificar la identidad de este. El sistema de API Staph consiste en micro ámpulas que contienen sustancias deshidratadas que permiten identificar a un desconocido de acuerdo a sus propiedades bioquímicas. Dado que el organismo bajo estudio resultó positivo para catalasa, se concluyó* era un estafilo y no estrepto y, por consiguiente, se realizaron las pruebas de API Staph, plasma de conejo y estriado en agar sangre. A partir del análisis realizado sobre estas pruebas y del manual bioM+riux, se calculó el número de perfil del desconocido #313 correspondiente a Staphylococcus xylosus. Introducción El identificar bacterias desconocidas tiene un rol muy importante en el ámbito m+dico, clínico y estudios microbiológicos y ecológicos. En el ámbito m+dico se debe conocer con exactitud la bacteria que está causando una infección para así proveer el antibiótico pertinente. Por su parte, es de gran inter+s para los microbiólogos y ecólogos el conocer la especie de bacteria siendo estudiada para conocer el impacto que tiene en todos los aspectos de la ecología. Especificar el g+nero y especie de una bacteria completamente desconocida por simplemente observar bajo un microscopio es un reto muy difícil para los microbiólogos. Para facilitar la identificación se han diseñado unos sistemas de pruebas miniaturizadas. Estas pruebas se basan en una serie reacciones bioquímicas, donde la presencia o ausencia de las reacciones, nos lleva a identificar el comportamiento y funciones de las bacterias siendo estudiadas. En este estudio se utilizó el sistema de pruebas conocido como API Staph, una de las cuatro pruebas existentes para lograr la identificación de bacterias desconocidas. La misma es un sistema estandarizado de pruebas para identificar organismos del g+nero Staphylococcus, Micrococcus y Kocuria. Para identificar el organismo, el API Staph utiliza pruebas bioquímicas miniaturas específicas junto con una base de datos adaptada a los resultados (bioM+rexus, 2013). El resultado obtenido de la prueba determinó que el organismo estudiado lo era el Staphylococcus xylosus. Staphylococcus xylosus es una bacteria que pertenece a la familia Staphylococcaceae. Esta es una bacteria Gram positiva que tiene una morfología y arreglo estafilococo, y es resistente a los cambios de su entorno. S. xylosus mayormente es encontrada en la piel y cavidades mucosas de los mamíferos y aves, pero tambi+n se puede sobrevivir en superficies y suelos. Además S. xylosus tiene una gran capacidad de crear biopelículas y debido a esto tiene importancia en la investigación genómica. (Leroy, S., Vermassen, A., Ras, G., & Talon, R. 2017) La bacteria tiene una importancia clínica mínima. Aunque es poco común, se han reportado casos de infecciones en seres humanos. Sin embargo, las infecciones son mayormente a personas que están predispuestas como las personas con un sistema inmunológico comprometido. Por tal

razón se considera que esta bacteria es un patógeno oportunista poco agresivo. Por otro lado, esta bacteria es utilizada mayormente por la industria de la comida, principalmente por la industria de la carne. La capacidad catabólica de piruvato y aminoácidos de la bacteria crean los olores típicos que se encuentran en la carne. Además, retarda la rancidez de la carne limitando la oxidación de los ácidos grasos (Leroy, S., Vermassen, A., Ras, G., & Talon, R. 2017) Metodología La prueba de coagulasa es el primer paso en la determinación de nuestro desconocido. Para la misma se utiliza un tubo serológico que contenga una solución salina de plasma de conejo. Esta plasma de conejo se inocula con nuestro desconocido #313 y se espera a ver si coagula o no. El sistema API Staph consiste de 19 micro ámpulas que contienen sustratos deshidratados y/o medios inoculados capaces de llevar a cabo pruebas bioquímicas. Primero, se prepara una solución salina 0.85% la cual se inocula con nuestro desconocido creando una suspensión para así luego transferir la misma a las micro ámpulas del sistema. Para la utilización de este, se identifica el sistema y se llena el fondo de la caja de incubación con agua hasta que todas las depresiones se llenen a capacidad. Luego, se saca la tira de prueba API de su envoltura y se coloca en el sistema que anteriormente se llenó de agua. Utilizando una pipeta Pasteur se inoculan las micro ámpulas del sistema con la suspensión creada, evitando siempre la formación de burbujas. Específicamente las pruebas incluidas en el sistema son D-glucosa (GLU), Dfructosa (FRU), D-mannosa (MNE), D-maltosa (MAL), D-lactosa (LAC), D-trehalosa (TRE), Dmanitol (MAN), xylitol (XLT), D-melibiosa (MEL), nitrato (NIT), fosfato alcalino (PAL), produccion de 2,3-butanodiol en Voges-Proskauer (VP), D-rafinosa (RAF), D-xylosa (XYL), Dsucrosa (SAC), methyl-αD-glucopyranoside (MDG), N-acetil-glucosamina (NAG), L-arginina (ADH) y urea (URE) (bioM+riux, 2013). Los espacios de ADH y URE se llenaron a mitad para así poder añadir aceite mineral y proveer anaerobiosis. Los demás espacios se llenaron a capacidad. El sistema se cubrió con la tapa plástica y se incubó aeróbicamente por 18-24 horas a 35-37°C. Se realizó la prueba de catalasa. Se esterilizó el cuello del tubo conteniendo el caldo con desconocido mediante el uso del mechero. Se utilizó un gotero para dispensar dos gotas de catalasa al caldo con el desconocido. Se repitió el procedimiento de esterilizar el cuello del tubo conteniendo el caldo con el desconocido. Se realizó la prueba de hemólisis en agar sangre. Se esterilizó el cuello del tubo conteniendo el caldo con desconocido mediante el uso del mechero. Se inoculó con un asa de inoculación el caldo conteniendo el desconocido. Se repitió el procedimiento de esterilizar el cuello del tubo conteniendo el caldo con desconocido. Se llevó a cabo un estriado en la placa Petri con agar sangre. Se incubó a 35 °C por 24 horas. Luego del periodo de incubación, a la prueba de VP se le añadió una gota del reactivo de Barritt’s A y una gota del reactivo de Barrit’s B al micro ámpula. A la prueba de NIT se le añadió una gota de ambos reactivos, nitrato A y nitrato B. Adicionalmente, se echó polvo de Zinc a esta prueba al cabo de 10 minutos. Por último, a la prueba PAL se le añadió una gota de

ambos reactivos, ZYM A y ZYM B. Se esperó 10 minutos para ver si se producía algún cambio en color. Se calculó el perfil num+rico en base a los resultados de las pruebas bioquímicas y se interpretó el mismo. En la hoja de resultados, se le adjudicó un signo de suma (+) a aquellas pruebas que resultaron positivas. Se sumó en cada grupo de tres pruebas todas aquellas que fueran positivas y se obtuvo el número de perfil de siete dígitos. Resultados Se logró identificar las características bioquímicas del desconocido utilizando las pruebas de catalasa y API Staph, que incluye pruebas para determinar la fermentación de azúcares, reacciones oxidativas, de hidrólisis y de degradación. De este modo se pudo determinar la capacidad que tiene la bacteria cuando se están realizando alguna de las pruebas antes mencionadas. para la prueba de catalasa no se observó efervescencia, que esta es características de un resultado positivo (Tabla 1). Tabla 1. Prueba de catalasa Prueba

Reactivos Añadido

Resultados Negativo

Catalas a

Positiv o

peroxido de hidrogeno No hubo formación de burbujas

Con respecto al sistema de API Staph se tiene que destacar que el control se mantuvo de color rojo y esto indica que no ocurre una reacción. En las pruebas de GLU, FRU, MNE, MAL, LAC, TRE, MAN, XYL, SAC y NAG no se observó cambio en la coloración esto indicando que los resultados para estas pruebas fueron positivos. Por otro lado, las pruebas de XLT, MEL, RAF Y MDG los resultados fueron negativos, ya que para los primeros tres el color cambio a un tono anaranjado y para MDG cambio a color rojo. Las pruebas de VP y NIT que son pruebas de sales se obtuvieron resultados positivos y negativos. Para la prueba de VP se obtuvo un resultado negativo debido a que la prueba cambió a un color rosado claro y la prueba de NIT obtuvo un resultado positivo debido a que este cambio a un color rojo/vino. La prueba de URE es una prueba de hidrólisis debido a que se utiliza la enzima de ureasa. Esta cambió a un color rosado fuerte esto indicando que la prueba tuvo un resultado positivo. En la prueba de ADH tuvo un resultado negativo, ya que la coloración de esta fue amarilla. Pero, la prueba de PAL se tornó de color violeta dando un resultado positivo, esto indica que la enzima de fosfatasa estaba presente. En adición a las pruebas de API Staph se realizaron las pruebas de agar sangre, catalasa y coagulasa. En la prueba de agar sangre se obtuvo una beta hemólisis, esto quiere decir que el

resultado fue negativo. Por último, para la prueba de coagulasa el resultado que se obtuvo fue negativo, debido a que el medio en el tubo no solidificó. De acuerdo a la variedad de pruebas bioquímicas presentes en el sistema API Staph se pudo asignar un número de perfil de 7 dígitos al microorganismo desconocido. Estos datos fueron calculados a partir de la suma de los resultados positivos agrupados por tríos de cúpulas. Se determinó que el número de perfil para el desconocido #313 fue 6736452. El mismo número de perfil corresponde a la bacteria Staphylococcus xylosus. Tabla2. Pruebas bioquímicas presentes en el sistema API Staph para el desconocido #313 Prueba s

Ingredientes activos

Reacciones/ Enzimas

Reactivos añadidos

Resultados

0

N/A

control negativo

-

GLU

D-glucosa

control positivo

-

amarillo

FRU

D-fructosa

acidificación

-

amarillo

MNE

D-manosa

acidificación

-

amarillo

MAL

D-maltosa

acidificación

-

amarillo

LAC

D-lactosa

acidificación

-

amarillo

TRE

D-trehalosa

acidificación

-

amarillo

MAN

D-manitol

acidificación

-

amarillo

XLT

Xilitol

acidificación

-

rojo/anaranjado

MEL

D-melibiosa

acidificación

-

rojo/anaranjado

NIT

Nitrato de potasio

reducción de nitratos a nitritos

NIT A + NIT B

PAL

β-fosfato naftil

fosfatasa alcalina

ZYM A + ZYM B

VP

Piruvato de sodio

producción de acetil-metilcarbinol

VP A + VP B

RAF

D-rafinosa

acidificación

-

XYL

D-xilosa

acidificación

-

amarillo

SAC

D-sacarosa

acidificación

-

amarillo

MDG

Metil-

acidificación

-

Negativo

Positivo

rojo

rojo violeta rosado claro

rojo/anaranjado

rojo

αD-“glucopyranoside ” NAG

N-acetil-glucosamina acidificación

ADH

L-arginina

URE

Urea

-

arginina dihidrolasa

-

ureasa

-

amarillo amarillo rojo/violeta

Discusión Durante este experimento se llevaron a cabo distintas pruebas bioquímicas para determinar la identidad de nuestro desconocido #313 con la utilización del sistema API Staph. Para la determinación de nuestro desconocido, Staphylococcus xylosus se hizo una prueba de coagulasa con plasma de conejo y se utilizó el sistema API Staph System producido por bioMerieux of Raleigh. La prueba de coagulasa se utiliza para diferenciar entre S. aureus y estafilococos coagulasa-negativos. Si coagula, significa que es positivo y que el microorganismo es S. aureus, si es negativo, es un estafilococo Gram positivo lo que indica que se utilizara el sistema API Staph y no el Api 20 E. Por otro lado, se utiliza este sistema para identificar 23 especies de cocos Gram positivos. Además, se hizo una prueba de catalasa para reafirmar la presencia de estafilococos. Se determinaron las pruebas más importantes dentro del sistema API Staph de acuerdo a los porcentajes más altos de reacciones positivas luego de una incubación de aprox. 48 horas a 36°C. Las mismas incluyen GLU, FRU, MNE, TRE, MAN y URE estas pruebas tuvieron un porcentaje igual o mayor a 90% (Tabla 3). Otras pruebas positivas pero que su porciento fue mayor de 80%, pero menor de 90%, fueron MAL, LAC, PAL, XYL, SAC y NAG (Tabla 3). Tabla 3. Porcentajes de identificación de API Staph para S. xylosus Api Staph

0

GLU

FRU

MNE

MAL

LAC

TRE

MAN

XLT

MEL

NIT

PAL

VP

RAF

XYL

SAC

MDG

NAG

ADH

URE

S. xylosus

0

10 0

10 0

92

81

85

95

90

30

9

82

75

67

11

82

87

10

80

5

90

Al momento de comparar el perfil experimental con el perfil teórico del manual de bioM+rieux, se pudo ver que no ocurrieron errores que pudieran cambiar el resultado de alguna de las pruebas. Esto nos deja saber que no hubo errores al momento de ejecutar las pruebas bioquímicas con el desconocido #313 y que el objetivo de poder determinar cada prueba se pudo llevar a cabo efectivamente. Las bacterias estafilococos son relevantes a la medicina puesto que son estas las que se encuentran en infecciones y presentan resistencia a los antibióticos. Por otro lado, no se asocia

como patógeno principal en medicina humana y veterinaria (Gozalo, A. S., Hoffmann, V. J., Brinster, R. L., Elkins, W. R., Ding, L., & Holland, S. M., 2010). No obstante, entre humanos y animales, es mucho más común en los animales. Este organismo está naturalmente presente en la carne cruda y la leche, además de ser utilizado en la cultura inicial para la fermentación de estos (Dordet-Frisoni, E., Dorchies, G., Araujo, C. D., & And, R. T., 2007). Además, S. xylosus es parte de la microbiota normal de la piel y otros animales. Infecciones causadas por este microorganismo es la dermatitis nasal en gerbils, un tipo de ratón, estafilococosis en aves e infección intramamaria en bovinos. En humanos se asocia a la pielonefritis tambi+n conocida como infección urinaria que a su vez es fácilmente tratada con antibióticos. Conclusión Las pruebas bioquímicas realizadas en el laboratorio resultaron ser exitosas para la identificación del microorganismo Staphylococcus xylosus. Adicionalmente, con los avances de la ciencia, ya existen otros m+todos moleculares tales como PCR que quizás son más específicos cuando se trata de identificación (Adzitey, F., Huda, N., & Ali, G. R. R., 2013). Otra desventaja de este sistema de API tiene que ver con el hecho de que, al contaminar un medio de la tira, usualmente se afectan todos los demás. Por otro lado, tambi+n se debe de tener en cuenta que estos medios son susceptibles a expiración y solo son capaces de identificar las especies ya presentes en la base de datos de API. El sistema API Staph es económico, requiere poca cantidad de muestra y nos ayuda a identificar un desconocido más allá de sus colonias y serologías. Además, es un sistema con alta precisión que provee una identificación completa y detallada consistente con el manual que utilizamos en la parte final de la identificación del desconocido. Por otro lado, el sistema API Staph tiene otras limitaciones ya que no se puede determinar otros factores que ayudan a determinar un desconocido como el origen del esp+cimen, las características de la colonia o su susceptibilidad hacia antibióticos. En adición, las pruebas de coagulasa y agar sangre ayudaron en la identificación del desconocido. A trav+s de las pruebas y el manual provisto por el instructor, se calculó el número de perfil del desconocido #313 correspondiente a Staphylococcus xylosus. Referencias 1. Adzitey, F., Huda, N., & Ali, G. R. R. (2013). Molecular techniques for detecting and typing of bacteria, advantages and application to foodborne pathogens isolated from ducks. 3 Biotech, 3(2), 97–107. http://doi.org/10.1007/s13205-012-0074-4 2. bioM+riux. (2013). API STAPH: Identification system for staphylococci, micrococci, and related genera. Extraído el 14 de enero de 2018, de https://www.mediray.co.nz/media/15784/om_biomerieux_test-kits_ot20500_package_insert-20500.pdf 3. Brown, A.E. (2012). Benson’s Microbiological Applications: Laboratory Manual in General Microbiology (12th ed.). New York, NY: McGraw-Hill. 4. Dordet-Frisoni, E., Dorchies, G., Araujo, C. D., & And, R. T. (2007, November 01). Emilie Dordet-Frisoni. Retrieved January 15, 2018, from http://aem.asm.org/content/73/22/7199.full 5. Gozalo, A. S., Hoffmann, V. J., Brinster, L. R., Elkins, W. R., Ding, L., & Holland, S. M. (2010, July). Spontaneous Staphylococcus xylosus Infection in Mice Deficient in NADPH

Oxidase and Comparison with Other Laboratory Mouse Strains. Retrieved January 14, 2018, from https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2919191/ 6. Leroy, S., Vermassen, A., Ras, G., & Talon, R. (2017, September). Insight into the Genome of Staphylococcus xylosus, a Ubiquitous Species Well Adapted to Meat Products. Retrieved January 15, 2018, from https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5620643/

Janeddie Rivera López BIOL3705-103 7012

Instructor: Jorge Viera Vera Número de estudiante: 801-15-

Insight into the Genome of Staphylococcus xylosus, a Ubiquitous Species Well Adapted to Meat Products Sabine Leroy, Aurore Vermassen, Geoffrey Ras, and R+gine Talon https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5620643/

Como se mencionó en el informe del desconocido, la bacteria Staphylococcus xylosus está naturalmente en la carne dada su alta concentración en la piel del ganado, además de ser utilizado para la fermentación de este producto. Este estudio, Insight into the Genome of Staphylococcus xylosus, a Ubiquitous Species Well Adapted to Meat Products, trata sobre cómo esta bacteria está bien adaptada a los sustratos de carne así usándolos como fuentes de carbono, energía y nitrógeno. Los autores de este artículo hicieron uso de las t+cnicas de análisis de genoma al igual que expresión in situ con un modelo de carne fresca, “steaks” y salchicha, para así notar que Staphylococcus xylosus a trav+s de la reducción de nitrato a nitrito contribuye al desarrollo del color y sabor a los distintos tipos de carne, además de muchas otras características producidas a trav+s de las fermentaciones que se llevan a cabo en la carne debido a esta bacteria. A trav+s de los m+todos utilizados industrialmente para la fermentación, esta bacteria ha resultado resistente a estos presentando una buena adaptación de la misma al sustrato utilizado, en este caso pedazos de carne. Además, S. xylosus es capaz de transportar 10 carbohidratos esenciales para proveer el sabor a la carne. S. xylosus utilizado como iniciador en asociación con una bacteria de ácido láctico con...