Inmunología básica - Tarea 4 - OT20 - Inmunoglobulinas PDF

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IV. INMUNOGLOBULINAS Y ANTICUERPOS Objetivos 1. Entender la estructura de las inmunoglobulinas y su bifuncionalidad (Fv y Fc) 2. Conocer las 5 clases (isotipos) de inmunoglubulinas y relacionarlo con su prevalencia, distribución y funciones características. 3. Entender la diversidad de los anticuerpos. 4. Conocer las interacciones de los anticuerpos con otros componentes del sistema inmune. 5. Entender el proceso de cambio de isotipo y el lugar donde ocurre. 6. Entender los conceptos epítope, parátope, afinidad, avidez, complejo inmune y reactividad cruzada. Estructura y bifuncionalidad de las inmunoglobulinas Las inmunoglobulinas (Ig) ocurren en 2 estados (Fig. 4.1; vea actividad 4.1): ● TransmembranaL, en la membrana celular de los LB como BCR (como visto en el capítulo 3). ● Humoral; secretado por las células plasmáticas que son las células efectoras de los LB. La Ig secretada por una célula plasmática tiene la misma especificidad que su LB precursor. Las Ig secretadas forman la parte humoral del SI adaptativo. La mayoría de las inmunoglobulinas secretadas se encuentran en la sangre y líquidos tisulares, aunque también hay inmunoglobulinas en las secreciones. Hay 5 clases de inmunoglobulinas que difieren entre sí según tamaño, carga, composición de aminoácidos y cadenas laterales de carbohidratos. Adicionalmente a la diferencia entre clases, cada clase es heterogénea. Tal heterogeneidad se detecta con (inmuno)electroforesis (Fig. 4.2)

Fig. 4.1 E lectroforesis del suero humano. Los picos representan la abundancia de proteínas sanguíneas principales separadas según su carga en un campo eléctrico; se clasifican como albumina, α1, α2, β y γ. Superpuesta se indica la contribución de los diferentes clases de Ig a los picos de proteínas séricas. La IgE tiene una movilidad similar al IgD, pero debido a su baja concentración es casi indetectable con esta técnica. Fuente: ref. 1. Roitt chapter 4_antibodies.pdf

Las inmunoglobulinas son glucoproteínas conformadas por 2 cadenas idénticas pesadas (H) y 2 cadenas idénticas ligeras (L), comúnmente presentadas en forma de ´Y´. Las cadenas ligeras consisten de 2 dominios, 1 variable y 1 constante, y las cadenas pesadas de 4-5 dominios, 1 variable y los demás constantes. Las cadenas son unidas por puentes disulfuros y también hay puentes disulfuros en los dominios. Los puentes disúlfuros estabilizan la estructura, por lo cual las inmunoglobulinas son de las proteínas de mayor resistencia al estrés (cambios de temperatura y pH). La cadena pesada determina la clase o el isotipo de una inmunoglobulina. Se distinguen 5 isotipos principales: IgG, IgA, IgM, IgE, e IgD (mnemónico: GAME-D). En el ser humano existen subclases para IgG (IGG1, IgG2, IgG3 e IgG4) e IgA (IgA1 e EgA2), pero además de esta mención no le prestamos mayor atención en este curso. Existen 2 tipos de cadenas ligeras, denominados kappa ( ) y lambda ( ). Todos los seres humanos expresan ambas cadenas ligeras, aunque suele predominar la κ. Sin embargo, en 1 inmunoglobulina, sólo un tipo de cadena ligera combina con la cadena pesada. En una inmunoglobulina, ambas cadenas H y L son idénticas.

Fig. 4.2 La estructura básica de una inmunoglobulina. La cadena ligera tiene aproximadamente 210 aminoácidos y la cadena pesada aproximadamente 450 aminoácidos. El conjunto (2H2L, químicamente un heterotetrámero) se considera una unidad funcional inmunológicamente llamado monómero. Un monómero tiene aproximadamente un peso molecular de 150 kD. La unión

entre las 2 cadenas pesadas se conoce como la bisagra. Sugerencia: pinta las cadenas pesadas verde y las cadenas ligeras en rojo. Bifuncionalidad en la estructura Tanto las cadenas H como las cadenas L tienen un dominio variable (resp. VH y VL) que contiene regiones hipervariables. El conjunto de las regiones variables de VH) y VL genera un sitio de unión con el antígeno conocido como parátopo. Así los fragmentos variables (Fv: VHVL) es la parte encargada del reconocimiento. Cada inmunoglobulina tiene por lo menos 2 Fv/parátopos. Un fragmento ‘Fab  se compone del Fv + el primer dominio constante de las cadenas (Fab = V HCH1 + VLCL) y tiene 1 parátopo. Cada inmunoglobulina tiene por lo menos 2 fragmentos Fab. La fragmentación de los inmunoglobulinas por la proteasa papaína genera 3 fragmentos: 2 fragmentos Fab y 1 fragmento cristalizable (Fc = CH2, CH3 de ambas cadenas o CH2, CH3  y CH4 de ambas cadenas). La fragmentación de las inmunoglobulinas por la pepsina genera 2 fragmentos: F(ab´)2 y Fc; F(ab)2 tiene 2 parátopos (Fig. 4.3). La parte Fc consiste de los dominios CH2, CH3 de ambas cadenas H (o, en algunos casos: CH2, CH3  y CH4 de ambas cadenas H). Esta parte tiene varios sitios para funciones efectores tales como activación de las células NK o macrófagos, activación de complemento, traspaso a través de la placenta o los epitelios, entre otras funciones. Los diferentes isotipos tiene diferentes funciones efectoras porque tienen diferentes cadenas pesadas: IgM tiene la cadena μ, Ig D la cadena δ, IgG la cadena γ, IgA la cadena α e IgE la cadena ε. Funciones efectores de Ig En general, pero no siempre, las funciones efectoras dependen de la Fc de una Ig. Las Ig humorales libres (es decir, que no están unidas con Ag) son inactivas. Pero al unirse un Ag afín al anticuerpo ocurren cambios conformacionales que exhiben sitios de interacción con otras proteínas. Un complejo inmune es un complejo multimolecular compuesto de anticuerpos y sus Ags afines. Se distinguen 5 funciones efectores principales: 1. Neutralización. La neutralización es simplemente el cubrimiento del antígeno o patógeno con anticuerpos. Es la única función efectora que basta con el Fab o F(ab)2, aunque el anticuerpo completo también lo realiza. Al cubrir el antígeno o patógeno esto ya no puede interactuar con los receptores de las células huésped. 2. Activación del complemento. La IgM y la IgG pueden activar el complemento vía la ruta clásica (vea capítulo X). El componente C1q del complemento reconoce complejos inmunes de IgM e IgG, es decir complejos de Ig y Ag, pero no IgM o IgG sin Ag. 3. Opsonización. Los complejos inmunes de IgG permiten que la Fc© se une al CD64 (=Fc©RI  de alta afinidad) de los macrófagos y activa la fagocitosis. Así, un macrófago que no reconocía al patógeno lo fagocito con el anticuerpo como intermediario. 4. ADCC / Citotoxicidad Celular Dependiente de Anticuerpos. Los complejos inmune de IgG permiten que la Fc© se une al CD16 (= Fc©RIII de baja afinidad) de las NK y las activa; es decir las NK liberan interferón gamma y matan a células vecinas con perforina y granzima. 5. Reagina; Activación/degranulación de eosinófilos, basófilos y células cebadas. La Fc∑   del IgE (libre, sin Ag) se une a sus receptores (Fc∑  R/CD23) en los basófilos, células cebadas y eosinófilos. Cuando un Ag afín se une a tal IgE se activan las células. ¿Cómo reaccionan estas células a esta activación? (Vea cap. 2).

Clases de inmunoglobulinas y sus características A pesar de las similitudes entre los dominios de los 2 tipos de cadenas L y los 5 isotipos de cadenas H, existen diferencias importantes entre los dominios ´constantes´, que especifican diferentes sitios efectores. Aparte de diferentes funciones efectoras, los diferentes isotipos se presentan en diferentes momentos de una respuesta inmune, en homeostasis están presentes en diferentes concentraciones sanguíneas, y tienen una distribución propia en el cuerpo (vea Actividad 4.3). IgM Las cadenas pesadas μ de la IgM tienen un dominio extra (Cμ4). La forma BCR de la IgM se expresa en los LB vírgenes (Bv), es decir los LB que recién salieron de la médula ósea, en compañía de la IgD. La forma humoral de las cadenas μ (IgM) tienen una cola adicional de 18 aminoácidos que se une a la cadena ´J´ (de inglés join) . Estas adaptaciones permiten la formación de un pentámero en forma de estrella (PM total aproximadamente 950 kD). Funcionalmente, la IgM resalta por 2 razones: 1. Es el fijador más potente del complemento; más potente. 2. Es la primera Ig detectable después de un reto inmune (aprox. 3-5 días). Por eso, la detección de anticuerpos IgM se considera una evidencia de una infección reciente. IgD La IgD se expresa como BCR en Bv. Está a una baja concentración en la sangre, y es más susceptible a proteólisis que los demás isotipos, por lo cual su vida media es corta. Su función es desconocida. (D de desconocido). IgA La IgA se presenta en la sangre como monómero, pero su presentación como dímero en las secreciones es más reconocida. Está presente en lágrimas, saliva, jugo intestinal y la lecha materna, entre otras secreciones. Para generar el dímero la célula plasmática produce la cadena J y libera el dímero IgA al espacio intersticial. La IgA pasa a través del epitelio por el proceso de transcitosis. Los epiteliocitos añaden una cadena  S (cadena secretor) a la IgA durante el proceso de transcitosis. La cadena S protege a la IgA contra ataque proteolítico por proteasas presentes en las secreciones. El mecanismo protector principal realizado por la IgA es la neutralización. IgG La estructura de la IgG es similar a la estructura general presentada en figura 4.3. La IgG es la Ig más abundante en la sangre. Es la única Ig que traspasa la placenta y protege al feto durante la vida intrauterina. La IgG cumple con la mayoría de las funciones efectoras: neutraliza, fija complemento (menos potente que la IgM), opsoniza (vía FCγRI/CD64 de los macrófagos) y tiene actividad ADCC (vía FCγRIII/CD16 de las NKs). Después de un reto, la IgG se detecta de día 7 en adelante. La detección de IgG contra un antígeno indica que la infección ya tiene más tiempo y está en la fase de convalescencia, que suele controlar la infección si otras fases de la respuesta inmune no lo lograron. IgE La IgE se presenta como monómero con una cadena ε con un dominio Cε4. Cuando es liberada por las células plasmáticas, los eosinófilos, basófilos y las células cebadas la captan vía sus FcεR. Por esto, es la Ig con menor concentración en la sangre. Cuando la IgE se une con su Ag afín, activa a la célula a la cual está unida. La IgE tiene un papel protector contra parásitos, pero su activación

no deseada en contra de alérgenos. La hipótesis de la higiene excesiva propone que por falta de exposición a parásitos el sistema está dispuesto/libre para reaccionar contra Ag no nocivos como alérgenos. Interacción del anticuerpo con el antígeno Los términos gammaglobulina, inmunoglobulina y anticuerpo no son sinónimos y vale ser consciente de las diferencias. En esta sección nos dedicamos más al término anticuerpo, ya que consideramos la interacción con el antígeno. La unión entre un antígeno y un anticuerpo involucra múltiples uniones no-covalentes: puente de hidrógeno, unión electrostático, unión Van del Waals y fuerzas hidrofóbicas. Individualmente, las fuerzas atractivas de las uniones no-covalentes son débiles en comparación con uniones covalentes. Sin embargo, la suma de las múltiples uniones no-covalentes genera una gran unión de fuerza total. La fuerza de interacción: La importancia de la conformación y distancia. Las uniones no-covalentes, y por ende la fuerza de unión Ag-Ac, depende críticamente de la distancia entre los grupos que interactúan. Para que los grupos del determinante antigénico o epítope y del parátope interactúan deben de acercarse suficientemente, por lo cual es de suma importancia que las conformaciones (formas) de ambos sean complementarias. Una vez cumplido esto se requiere complementariedad entre los puentes de hidrógeno, las fuerzas electrostáticas y fuerzas Van der Waals y similitud para la fuerza hidrofóbica (Fig. 4.4). Debido a que la unión depende de uniones no-covalentes, esta unión es reversible; asociable y disociable. Así la Ley de acción de masas aplica a la interacción y se puede determinar el constante de equilibro: la razón [AgAc]/[Ag][Ac]. La fuerza de unión entre un epítope y un parátope se conoce como afinidad. La afinidad es la suma de las fuerzas atractivas y repulsivas que ocurren en una interacción. Un anticuerpo tiene 2 parátopes iguales y por ende es multivalente. Igualmente, el antígeno puede repetir el mismo epítope. La avidez es la fuerza con la cual un anticuerpo multivalente está unida a un antígeno multivalente. La avidez depende de la afinidad, pero es mayor a la suma de las afinidades individuales. Aunque se consideren que la interacción entre un anticuerpo y un antígeno es específico, la especificidad va dirigida a la complementariedad entre el epítope y el parátope. Cuando otro antígeno comparte el mismo epítope será reconocido. El fenómeno que un anticuerpo reconoce a otro antígeno que el antígeno afín se conoce como reactividad cruzada. La reactividad cruzada puede ser con afinidad alta o afinidad menor.

Figura 4.3 Complementariedad  y fuerzas no-covalentes en la interacción Ac-Ag. Ref. 1 modificado

El cambio de isotipo En el capítulo anterior se describió los mecanismos por los cuales se generan la diversidad de los BCR. Los LB maduros vírgenes (LBv) que son liberados de la médula ósea han recombinado los segmentos de diversidad (VDJ) y así se queda determinada la especificidad para este LB y toda su descendencia. Río debajo de los segmentos VDJ en la cadena pesada se codifican los dominios de los isotipos en el siguiente orden: μ, δ, γ, ε, α. Cada cadena pesada tiene su señal de recombinación (S) con excepción de δ. Los LBv producen BCR de tipo IgM e IgD de la misma especificidad. Cuando los LBv encuentran su Ag cognato o afín ocurre la selección clonal y la conversión en células plasmáticas que secretan anticuerpos (Ac) con la misma especificidad (VDJ) y del isotipo IgM cuando ocurrió sin ayuda de Th. Sin embargo cuando los LBv son activados con ayuda de Th2, es decir, reciben citocinas y activación de sus receptores CD40, se convierten en células plasmáticas y LB de memoria (LBm) con la misma especificidad (VDJ) pero con un cambio de isotipo, ya sea IgG (más comúnmente), IgE o IgA (Fig. 4.5). La activación de los LBv con ayuda de Th suele ocurrir en los órganos linfáticos secundarios.

Figura 4.5 Esquema de cambio de isotipo. La figura demuestra como ocurre el cambio de isotipo sólo para la IgG; sin embargo procesos similares ocurren para el cambio a IgE o IgA. Ref. 1 modificado. Referencias 1. Roitt´s Essential Immunolgy, 13th Ed. ISBN: 978-1-118-41577-1, Delves PJ, Seamus JM, Burton DR, Roitt IM, Wiley-Blackwell 2017. Animaciones: h  ttp://www.roitt.com/animations.asp

ACTIVIDADES (Entrega solamente las hojas con actividades; entrega tarde no se recibe)

 ealiza un d Actividad 4.1 : R  ibujo de un anticuerpo secretado e indique (2 0 p; 2p/aspecto)

1. los dominios: CH 2, CH 3, a. VH , CH 1,    2. los fragmentos Fv, Fc, Fab, F(ab´)2 3. los puentes disulfuros entre las cadenas 4. la bisagra. Anticuerpo secretado

Actividad 4.2 Conteste correcta y concisamente con palabras claves. (30 p; 2 p/inciso)

1. ¿Cuáles isotipos tienen 3 dominios CH? IgG, IgA 2. ¿Cuáles isotipos tienen 4 dominios CH? IgE, IgM 3. ¿Cuáles dominios forman el Fv? VH y VL 4. Al fragmentar IgG con papaína ¿Cuáles dominios forman el Fc y el Fab, respectivamente? FC (Fragmento Cristalizable): dominios CH 2, CH 3 de ambas cadenas o CH2, CH3  y CH4 de ambas cadenas. FAB: Fv y el primer dominio constante de ambas cadenas (VHCH1 + VLCL). 5. ¿Cuáles células tienen los Ig como BCR en su superficie? Linfocitos B (LB) 6. ¿Cuáles células secretan los Ig como anticuerpos, es decir como factores humorales? Células plasmáticas 7. ¿Cuál isotipo de anticuerpo ocurre como pentámero? IgM 8. ¿Cuál isotipo de anticuerpo puede ocurrir como monómero o dímero? IgA 9. ¿Cuál cadena tienen los anticuerpos que ocurren como multímeros? Cadena J 10. ¿Cuál célula produce la cadena del inciso anterior? Célula plasmática 11. ¿Cuál isotipo ocurre en las secreciones? IgA 12. ¿Cuál cadena protege el anticuerpo en las secreciones contra la degradación? Cadena S 13. ¿Cuál célula produce la cadena del inciso anterior? Epiteliocitos 14. ¿Dónde se encuentran los puentes disulfuros intercatenarias? (describir con palabras) En la unión de las cadenas H y L. 15. ¿Dónde más hay puentes disulfuros en la Ig? Entre los dominios, en la región bisagra.

Actividad 4.3. Complementa la tabla con las funciones que correspondan a cada isotipos Ig. Utilice  or esta funcionalidad; ´-´ = función no es característica de la Ig. (35 p; un ´+´ = la Ig r esalta p 1p7/campo.)

Tabla 4.1 Características fisicoquímicas y funcionales de los diferentes tipos de Ig humanos Isotipo Ig IgA IgM Características fisicoquímicas γ α μ Monómero Sangre: Pentámero monómero Secreción: dimero 150 Sangre: 150 950 Secreción: 390 2.5 9 12 IgG

Cadena H # unidades

PM (kD) Carbohidrato (% PM)

IgD

IgE

δ Monómero

ε monómero

180

190

12

12

[ ]suero (mg/mL)

14

4

1.5

0.03

0.00005

T1/2 (días)  Distribución intravascular (%)

21 45

6 42

10 80

3 75

2 -

Presente en secreciones

+ + + + -

+ -

-

+

Características funcionales Traspasa placenta Neutraliza Activa complemento Opsonización ADCC (activa NK) Activación de basófilos, células cebadas y eosinófilos

+ + + -

Actividad 4.4 Seleccione la mejor respuesta. (15 p) 4.4.1 Considerando la misma especificidad ¿Cuál isotipo de anticuerpos tendrá la mayor avidez? a. IgA b. IgD c. IgE d. IgG e. IgM . 4.4.2 ¿Cuál es más relevante en situaciones fisiológicas?  a. Afinidad . b. Avidez 4.4.3 ¿Cuál de los antisueros (Ac1 o Ac2) tiene mayor avidez?   = 0.003M.  b. KAc2   = 0.0001 M a. KAc1

Introducción El ensayo de reducción de plaques determina la presencia de anticuerpos antivirales específicos en una muestra de suero del paciente. Los resultados del ensayo son los siguientes: ● 1 cultivo de células huésped sin virus (control negativo). Se observa células normales ● 1 cultivo de células huésped con virus (control positivo). Se observan placas de lisis celular. ● 1 cultivo de células huésped con virus y el suero del paciente. No se observa lisis celular.

4.4.4 ¿Cuál es la conclusión respecto al paciente? a. El paciente no tiene anticuerpos específicos; no está infectado con el virus. b. El paciente no tiene anticuerpos específicos; está infectado con el virus. c. El paciente tiene anticuerpos específicos; no está infectado con el virus. d. El paciente tiene anticuerpos específicos; está infectado con el virus. 4.4.5. ¿Cuál isotipo de Ig puede activar las NK? a. IgA b. IgD c. IgE

d. IgG

e. IgM

Puntas extra (5 p): Investigue (¡referencias!) y explique concisamente el concepto de hipogammaglobulinemia transitorio de la infancia, así como el impacto en su vulnerabilidad ante infecciones. El bebe no recibe nada de IgM, IgA o IgE materna ya que estas no atraviesan la placenta. Más de la mitad de los niños con THI tienen niveles de IgG menores a 200 mg/dl. Ocasionalmente algunos pacientes con THI desarrollan infecciones serias, tienen niveles de IgG persistentemente bajos y defectos funcionales de los anticuerpos y pueden tener una enfermedad parecida a la CVID que persista por muchos años o permanentemente.

REFERENCIA: Hipogammaglobulinemia Transitoria de la Infancia. (2002). Manual para Pacientes y Familiares (37–41). https://primaryimmune.org/sites/default/files/Cap%C3%ADtulo%207%20-%20Hipogammaglobulinemia%20 Transitoria%20de%20la%20Infancia.pdf

Referencias 1. Roitt´s Essential Immunolgy, 13th Ed. ISBN: 978-1-118-41577-1, Delves PJ, Seamus JM, Burton DR, Roitt IM, Wiley-Blackwell 2017. 2. Animaciones: http://www.roitt.com/animations.asp...