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LABORATORIO N° 03 – IUNIDADÍNDICE ENZIMAS DE OXIDOREDUCCIÓN BIOLÓGICA...................................................................... PRÁCTICA N° 06: DEMOSTRACION DE LA DISTRIBUCIÓN INTRACELULAR DE LAS I. FINALIDAD...................................................................................

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LABORATORI O N° 03 – I UNIDAD

ÍNDICE PRÁCTICA N° 06: DEMOSTRACION DE LA DISTRIBUCIÓN INTRACELULAR DE LAS ENZIMAS DE OXIDOREDUCCIÓN BIOLÓGICA......................................................................2 I.

FINALIDAD..........................................................................................................................2

II.

METODOLOGÍA..................................................................................................................2 1.

REACTIVOS A UTILIZAR:.............................................................................................2

2.

PROCEDIMIENTO:.........................................................................................................2

III.

INTREPRETACIÓN DE RESULTADOS.......................................................................5

IV.

CONCLUSIÓN.................................................................................................................6

V.

CUESTIONARIO.................................................................................................................6

VI.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................................8

PRÁCTICA N° 08: EFECTO DE INHIBIDORES SOBRE LA CADENA DE OXIDOREDUCCIÓN BIOLÓGICA...............................................................................................9 I.

FINALIDAD..........................................................................................................................9

II.

METODOLOGÍA..................................................................................................................9 1.

REACTIVOS A UTILIZAR:.............................................................................................9

2.

PROCEDIMIENTO:.........................................................................................................9

III.

INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS.....................................................................12

IV.

CONCLUSIONES..........................................................................................................13

V.

CUESTIONARIO...............................................................................................................13

VI.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS..........................................................................16

LABORATORIO N° 03 – I UNIDAD

1

PRÁCTICA N° 06: DEMOSTRACION DE LA DISTRIBUCIÓN INTRACELULAR DE LAS ENZIMAS DE OXIDOREDUCCIÓN BIOLÓGICA

I.

FINALIDAD

Objetivizar la distribución intracelular de las enzimas de óxido-reducción de la cadena respiratoria usando los indicadores 2-6 diclorofenilindofenol y la pfenilendiamina, y los componentes celulares de un homogenizado de hígado de rata por centrifugación diferencial mediante el método de Schreider y col.

II.

METODOLOGÍA 1. REACTIVOS A UTILIZAR:  Buffer fosfato de sodio 0.1 M pH 7.4 

2,6 diclorofenolindofenol 0.02 %



Succinato 0.1 M



P-fenilendiamina 1 %



Homogenizado total de hígado de ratas en sucrosa 0.25 M



Fracción nuclear del homogenizado



Fracción mitocondrial del homogenizado



Fracción microsomal soluble del homogenizado.



KCl 0.154 M

2. PROCEDIMIENTO:  Armar el siguiente sistema: COMPONENTES

I

II

III

IV

V

Buffer fosfato de sodio 0.1 M, Ph 7.4

1.0

0.5

0.5

0.5

0.5

2,6 diclorofenolendofenol

1.0

1.0

1.0

1.0

1.0

Succinato de sodio 0.1 M Fracción nuclear

0.2

0.2 - 0.5

0.2

0.2

0.2

-

Fracción mitocondrial Fracción microsomal

-

- 0.5 -

Homogenizado total

-

-

-

-

-

-

0.5 -

- 0.5

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 Mezclar y dejar en reposo a temperatura ambiente  Observar constantemente y anotar los cambios de color del indicador, para interpretar los resultados.

IMAGEN DE LABORATORIO DEL PRIMER SISTEMA

 Armar otro sistema, empleando: COMPONENTES Buffer fosfato 0.1M, pH7,4 p-fenilendiamina 1% (sustrato +indicador) Fracción nuclear Fracción mitocondrial

I 1.5 0.5

II 1.0 0.5

III 1.0 0.5

IV 1.0 0.5

V 1.0 0.5

0.5 0.5

Frracción microsomal-soluble Homogenizado total

0.5 0.5

 Mezclar y dejar en reposo a temperatura ambiente.  Observar constantemente y anotar los cambios de color del indicador, para interpretar los resultados.

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IMAGEN DE LABORATORIO DEL PRIMER SISTEMA

 Buffer fosfato de sodio: se usa como tampón, para mantener el pH óptimo así sea después de agregar algún ácido o base fuerte o débil.  2,6- diclorofenolindofenol: Colorante redox que en estado oxidado (perdió electrones) es azul, y en estado reducido (ganó electrones), incoloro.  p – fenilendiomina: Es un colorante redox pero que va a reducir a la citocromo oxidasa, por lo que al quedar oxidado va a dar un color marrón oscuro o azul oscuro, en cambio, en estado reducido, el color que da es un marrón claro o casi lila.  Succinato 0.1M: Representa el sustrato de la enzima de la cadena respiratoria  Homogenizado total de hígado: Representa el compuesto en el que la enzima se encuentra. Las membranas internas de las mitocondrias de los hepatocitos contienen la cadena respiratoria, dentro de esta y formando el complejo II, está la succinato deshidrogenasa. LABORATORIO N° 03 – I UNIDAD

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 Fracción nuclear: Mediante la técnica del fraccionamiento celular, se puede aislar partículas específicas de la célula con un alto grado de pureza y concentración. En este caso, la fracción nuclear representa el núcleo celular.  Fracción mitocondrial: En este otro caso, el aislamiento de las partículas se refiere a las mitocondrias.  Fracción microsomal: Y en este, las partículas aisladas son microsomas, que representa el conjunto de Complejo de Golgi, Retículo endoplasmático y Membrana celular.

III.

INTREPRETACIÓN DE RESULTADOS 1. ANÁLISIS DEL PRIMER DICLOROFENOLENDOFENOL

SISTEMA

CON

2,6

TUBO I: Contiene el Buffer, más el colorante indicador y el sustrato. Obviamente no hay reacción pues no hay presencia de enzimas ni de sus coenzimas transportadoras de electrones. Por tanto, el color final es Azul (colorante está oxidado) TUBO II: En este tubo aparte de todo lo anterior, se agrega la fracción nuclear. En esta no hay presencia de enzimas oxidoreductasas por lo que no hay transferencia de electrones y tampoco reducción del colorante. Por tanto, el color es azul. TUBO III: En este tubo se cambia la fracción nuclear por la mitocondrial, esto significa presencia de enzimas de la cadena respiratoria y transferencia de electrones, el FAD se reduce a FADH en la reacción mediada por la succinato deshidrogenasa, y esta coenzima a su vez reduce al colorante, haciendo que cambie de azul a incoloro. TUBO IV: Lo nuevo es que se agrega la fracción microsomal, un conjunto de partículas que no contienen enzimas oxidoreductasas que reaccionen con el succinato y a la vez reduzcan al transportador, por tanto, el colorante no se reduce. Sigue siendo azul.

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TUBO V: En este tubo se añade, en pocas palabras, la célula completa. Hay reacción por la presencia de enzimas. El preparado es incoloro. Este tubo es un controlador que nos indica la presencia necesaria de reacción para que de ahí se parta a analizar las otras ubicaciones. Si este tubo fuera negativo, color azul, no tendría sentido empezar el procedimiento para los demás. 2. ANÁLISIS DEL SEGUNDO SISTEMA CON p-FENILENDIAMINA TUBO I: No hay enzimas y por lo tanto no hay reacción. Se mantiene el color marrón claro. TUBO II: No hay enzimas y por lo tanto no hay reacción, solo hay fracción nuclear donde solo se encuentran núcleos y células íntegras. Se mantiene el color marrón claro. TUBO III: En la fracción mitocrondrial encontramos mitocondrias, lisosomas y peroxisomas, aquí hay enzimas y por lo tanto hay reacción. El tubo se torna de color marrón oscuro, pues el colorante se oxida. TUBO IV: En la fracción microsomal se encuentra RER, REL y ribosomas, aquí no hay enzimas. Y por lo tanto no hay reacción. Se mantiene el color marrón claro o lila. TUBO V: En el homogeneizado se encuentran todas las fracciones, si hay enzimas y por lo tanto hay reacción, hay cambio de color a marrón oscuro.

IV.

CONCLUSIÓN

Tanto las fracciones nucleares, mitocondriales y microsomales fueron obtenidas de la célula hepática de un mismo tejido, entonces lo que se quiere es indicar la localización intracelular de las enzimas oxidoreductasas indicada por la reacción positiva (color incoloro). En el Tubo I no hay reacción, por tanto, las enzimas no están ubicadas a nivel del núcleo; sin embargo, en el tubo III si la hay, de ello se afirma que las enzimas están a este nivel, mitocondrial.

V.

CUESTIONARIO

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6

1.

¿Qué es el 2,6 diclorofenolindofenol y cómo actúa en la cadena respiratoria?

El 2,6-diclorofenolindofenol es un derivado clorado del fenol con la fórmula química C6H4Cl2O el cuál actúa como un indicador, cuyo estado normal es oxidado a un color azul, y cuando se reduce ocurre un cambio a blanquecino. En la cadena respiratoria, este compuesto actúa en el complejo I, entre el FMN y la ubiquinona (coenzima Q). 2.

¿Qué es el p-fenilendiamina y cómo actúa en la cadena respiratoria?

El p-fenilendiamina es un indicador redox, cuyo estado normal es reducido a un color marrón claro, y cuando se oxida ocurre un cambio a color marrón oscuro. En la cadena respiratoria, este compuesto actúa cediendo electrones al citocromo 3.

Grafique usted en una cadena de óxido-reducción biológica e indique la acción de los indicadores redox 2,6 diclorofenolindofenol y p-fenilendiamina

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4.

¿Qué es un homogenizado de hígado y cómo se obtienen las fracciones celulares por centrifugación diferencial?

El homogeneizado de hígado se obtiene al homogenizar 10 gr de hígado cortados en fragmentos pequeños. Se coloca en el homogenizador Potter y se le agrega 0.154 M de KCl. Se hace presión manualmente con el émbolo girando hacia el fondo, trabajándose entre 0 y 4ºC. El homogenizado es centrifugado a 800 revoluciones por 10 minutos colocándolo en tubos de polietileno, previa calibración en la balanza, se emplea una centrífuga refrigerada. El sobrenadante es separado en un beaker de 500ml. El sedimento constituye la fracción nuclear y se coloca en un beaker de 100ml. El sobrenadante anterior es centrifugado a 15000 revoluciones por 15 minutos en la centrífuga refrigerada. Se separa el sobrenadante en un beaker, constituyendo la fracción microsomal con el citosol. El sedimento se separa en otro beaker y constituye la fracción mitocondrial.

VI.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Rodwell V, Bender D, Botham K, Kennelly P, Weil P. Harper bioquimica iustrada. 30th ed. Mexico: McGRAW-HILL INTERAMERICANA EDITORES S.A de C.V; 2016.

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PRÁCTICA N° 08: EFECTO DE INHIBIDORES SOBRE LA CADENA DE OXIDOREDUCCIÓN BIOLÓGICA

I.

FINALIDAD

Demostrar que los inhibidores: rotenona, barbital sódico y azida de sodio, actúan en las regiones cercanas al sitio I, sitio II y sitio III, respectivamente, mediante el uso de indicadores conocidos como 2 – 6 diclorofenolindofenol y p – fenilendiamina.

II.

METODOLOGÍA 1. REACTIVOS A UTILIZAR: 

Buffer fosfato de sodio 0.1M, pH: 7.4



2,6-diclorofenolindofenol 0.02 %



p-fenilendiamina 1%



Malato de sodio 0.1M



Rotenona 0.1M



Barbiturato de sodio 0.1M



Azida de sodio



Fracción mitocondrial 10% (hígado de rata).

2. PROCEDIMIENTO: 

En el sistema Deshidrogenasa málica + malato + cadena rédox mitocondrial, verificar

el efecto de los inhibidores: rotenona, barbital

sódico y azida de sodio.

 Armar el siguiente sistema:

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TUBOS COMPONENTES (en ml.)

I

II

III

IV

V

VI

1.2 1.0 -

1.5 1.0 0.2

1.0 1.0 0.2

0.5 1.0 0.2

0.5 1.0 0.2

0.5 1.0 0.2

Rotenona 0.1M

-

-

-

0.5

-

-

Barbiturato de sodio

-

-

-

-

0.5

-

0.5

-

0.5

0.5

0.5

0.5 0.5

Buffer fosfato 0.1M pH 7.4 2, 6-diclorofenol indofenol 0.02 % Malato 0.1M

Azida de sodio Homogenizado mitocondrial 10%

 Mezclar, dejar en reposo a temperatura ambiente por 20 minutos.  Observar y anotar los resultados (cambios de color en cada uno de los tubos).

1

2

3

4

5

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IMAGEN DE LABORATORIO: sistema Deshidrogenasa málica + malato + cadena rédox mitocondrial, verificar el efecto de los inhibidores: rotenona, barbital sódico y azida de sodio.

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

En el sistema p–fenilendiamina + cadena rédox mitocondrial, verificar el efecto de los inhibidores rotenona, barbital sódico y azida de sodio. 

TUBOS

COMPONENTES (en ml.) Buffer fosfato de sodio 0.1M pH 7.4 Azida de sodio Barbiturato de sodio 0.1M Rotenona 0.1M P–fenilendiamina 1% Homogenizado de mitocondrias 10%

I 2.0 0.5 -

II 1.5 0.5 0.5

III 1.0 0.5 0.5 0.5

IV 1.0 0.5 0.5 0.5

V 1.0 0.5 0.5 0.5

 Mezclar, dejar en reposo a temperatura ambiente por 20 minutos.  Observar y anotar los resultados (cambios de color en cada uno de los tubos).

1

2

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5

IMAGEN DE LABORATORIO: Sistema p–fenilendiamina + cadena rédox mitocondrial, verificar el efecto de los inhibidores rotenona, barbital sódico y azida de sodio.

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III.

INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS 1. SISTEMA DESHIDROGENASA MÁLICA + MALATO + CADENA RÉDOX MITOCONDRIAL, VERIFICAR EL EFECTO DE LOS INHIBIDORES: ROTENONA, BARBITAL SÓDICO Y AZIDA DE SODIO

TUBO I: No hay sustrato pero si hay enzimas, por lo tanto no hay reacción. Se mantiene el color azul. TUBO II: Si hay sustrato pero no hay enzimas, por lo tanto no hay reacción. Se mantiene el color azul TUBO III: Si hay sustrato y enzimas pero no hay inhibidor, por lo tanto si hay reacción. Cambia de color azul a blanquecino celeste. TUBO IV: Si hay sustrato, enzimas e inhibidor (rotenona). La rotenona actúa a nivel del complejo I, no permite la reducción del 2,6 – diclorofenolindofenol. Se mantiene el color azul. TUBO V: Si hay sustrato, enzimas e inhibidor (barbiturato de sodio). El barbiturato de sodio actúa a nivel del complejo III, lo cual permite un cambio parcial en cuanto al color. El color será de un verde azulado. TUBO VI: Si hay sustrato, enzimas e inhibidor (azida de sodio). La azida de sodio actúa a nivel del complejo IV, inhibiendo el paso de electrones de Cit c a Hem a + a3, pero hay reacción debido a que el 2,6 – diclorofenolindofenol actúa a nivel del complejo I. El color cambia de azul a blanquecino. 2. SISTEMA P–FENILENDIAMINA + CADENA RÉDOX MITOCONDRIAL, VERIFICAR EL EFECTO DE LOS INHIBIDORES ROTENONA, BARBITAL SÓDICO Y AZIDA DE SODIO. TUBO I: Si hay sustrato, pero no hay enzimas, por lo tanto, no hay reacción. Se mantiene el color marrón claro. TUBO II: Si hay sustrato y enzimas, pero no hay inhibidor, por lo tanto, si hay reacción. Cambia de color a marrón oscuro.

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TUBO III: Si hay sustrato, enzimas e inhibidor (azida de sodio). La azida de sodio actúa a nivel del complejo IV, inhibiendo el paso de electrones de Cit c a Hem a + a3, y el p-fenilendioamina actúa a ese nivel, por lo tanto, no hay reacción. Se mantiene el color marrón claro. TUBO IV: Si hay sustrato, enzimas e inhibidor (barbiturato de sodio). El barbiturato de sodio actúa a nivel del complejo III inhibiendo, por lo que se deduce que si hay reacción. Cambia de color a marrón oscuro. TUBO V: Si hay sustrato, enzimas e inhibidor (rotenona). La rotenona actúa a nivel del complejo I, pero el p-fenilendioamina actúa en el cit C, por lo que se deduce que si hay reacción. Cambia de color a marrón oscuro.

IV.

CONCLUSIONES 

Las enzimas se encuentran compartamentalizadas, de manera que el citoplasma, la matriz mitocondrial y la matriz nuclear son independientes en su contenido.



El 2,6-diclorofenolindofenol y el p-fenilendiamina pueden ser usados como buenos indicadores redox.

V.

CUESTIONARIO 1. ¿Qué inhibidores de la cadena de óxido reducción conoce y a qué nivel actúan? COMPLEJO

I

II



INHIBIDORES Amobarbital



Pericidina A



Rotenona



Amital



Esteroides



Halotano

 

Detergentes Malonato LABORATORIO N° 03 – I UNIDAD

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III

IV

DESACOPLADORE S

 

Carboxina Antimicina A



Barbiturato de sodio



Hidroxiquinilina N-+oxido



BAL

 

Dimercaprol H2 S



CO



Cianuro

 

Azida de Sodio 2,4 Dinitrofenol



Termogenina



Dinitrocresol



Pentaclorofenol



CCCP: Cloro carnonil cianuro fenilhidrazona

2. ¿Si utiliza el indicador rédox 2,6-diclorofenolindofenol en un sistema con cadena respiratoria, que cambios observaría con la rotenona, barbiturato de sodio y azida de sodio? EFECTO DE: 2,6-

ROTENONA BARBITURATO DE SODIO AZIDA DE SODIO

DICLOFENOLINDOFENOL No permite reducción, indicador permanece oxidado (azul). Inhibición en sitio I Indicador decolora a amarillo, existe inhibición en sitio II Indicador decolora a blanco, existe inhibición en sitio III.

3. ¿Si utiliza el indicador p–fenilendiamina en un sistema con...