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Difetti della struttura dell’emoglobina: emoglobinopatie e talassemie Lezione del 08/03/2016, Prof. Iolascon

Sbobinatura di Roberta Travascio

Oggi parliamo della patologia recessiva forse più paradigmatica vale a dire la talassemia perché sulla patologia del globulo rosso è stata fondata la maggior parte delle conoscenze della genetica soprattutto le malattie epiteliali. Il globulo rosso è una cellula particolare che si è così differenziata che non ha più la possibilità di replicare, infatti ha perso il nucleo al termine della differenziazione ed è formato per il 95% da emoglobina, per il resto troviamo solo alcune attività enzimatiche. Si formano nel midollo osseo da un precursore comune a tutte le cellule del sangue che replicandosi si differenzia prima in un precursore capace di produrre piastrine e globuli rossi e successivamente in precursore che produce solo globuli rossi. Quando arriva al livello di progenitore del globulo rosso inizia la sintesi della componente principale che è l’emoglobina che detta anche l’uscita del nucleo dall’eritrocita. Se il globulo rosso non raggiunge una certa concentrazione di emoglobina, la picnosi del nucleo non avviene e il globulo rosso va in contro ad altre divisioni cellulari e diminuisce un po’ il suo volume. In seguito a deficit di emoglobina quindi il globulo rosso diminuisce il suo volume perché va in contro a più cicli replicativi. -Cos’è l’emoglobina? L’emoglobina è una molecola tetramerica, composta da 4 unità uguali a due a due. Ogni unità è formata da una catena proteica (globina) e da un nucleo prostetico (eme) composto da un anello tetrapirrolico che contiene al centro un atomo di ferro, questo permette il trasporto dell’ossigeno. L’emoglobina dell’adulto è l’emoglobina A (HbA) formata da due catene α e da due catene β, ma non sono le uniche catene presenti nell’emoglobina, per esempio l’emoglobina fetale (HbF) è α2γ2 e ancora prima durante la vita embrionale viene prodotta altra emoglobina con analoghi delle globine α cioè ζ(zeta). L’emoglobina subisce nel tempo un fenomeno che viene indicato come Switch dell’emoglobina cioè cambiamento dell’emoglobina. L’emoglobina embrionale è formata da emoglobina ε e ζ, poi comincia la sintesi di α e γ durante la vita fetale, durante la vita adulta comincia anche la sintesi della globina δ(delta) che è molto piccola rispetto alla sintesi di β. Un altro cambiamento che avviene nel corso del tempo è la sede di produzione del globulo rosso: durante la vita embrionale è il sacco vitellino, durante la vita fetale l’eritropoiesi avviene in sede epatica poi compare nella milza e infine nel midollo che poi è l’unica sede eritropoietina nell’adulto. Se però in un individuo adulto ci sono problemi per cui il midollo non riesce a sostenere l’eritropoiesi, questa può presentarsi anche in sede eterotopica come nella milza o nel fegato. L’altra caratteristica da tenere in considerazione è che la forma del globulo rosso cambia nel corso del tempo perché è una cellula molto grande e durante la vita embrionale è un megaloblasto con ancora il nucleo, poi diventa macrocito quindi ancora con il volume aumentato durante la vita fetale e diventa un normocito di circa 80 femtolitri durante la vita adulta. Da questo si evince che contemporaneamente allo Switch dell’emoglobina avviene uno Switch della sede di produzione del globulo rosso e della sua forma e tutto questo è estremamente coordinato. -Quali sono i tipi di emoglobine noti? 

Emoglobine embrionali formate dai tetrameri ζ2γ2 oppure ζ2ε2 (quindi è evidente che ζ è la controparte di α e che γ ed ε sono la controparte di β) Sede di formazione: sacco vitellino

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Emoglobina fetale che è un tetramero α2γ2 (le γ-globuline non sono tutte uguali, i geni che producono γ-globuline sono due e sono geni molto simili tra di loro la cui unica differenza è che uno produce una catena che possiede nel residuo 126 la glicina e l’altro la (???) quindi un unico Amminoacido di differenza) Sede di formazione: fegato poi milza Emoglobine della vita adulta formate dal tetramero α2β2 (HbA) per il 97% (quindi la quasi totalità) e dal tetramero α2δ2 (HbA2) per il 2,5% Sede di formazione: midollo osseo

Durante la vita adulta esiste una piccola quantità di emoglobina fetale α2γ2 che continua ad essere prodotta, questa quantità (HbF 0,5%) in un adulto normale non è che viene prodotta in tutti i globuli rossi allo 0,5%, esiste una piccola quantità di globuli rossi che viene prodotta quotidianamente rappresentata da globuli rossi del tutto simili a quelli prodotti durante la vita fetale e queste vengono dette F-cellule o cellulle fetali che contengono una grossa quantità di emoglobina fetale quindi è come se noi continuassimo ad avere un ricordo di produzione di emoglobina fetale durante la vita adulta. Questo fenomeno dello Switch dell’emoglobina è un fenomeno che dipende da un controllo trascrizionale molto attento, anche farmacologicamente manipolabile, per cui si può indurre nuovamente una certa quantità di sintesi dell’emoglobina che prima non era più prodotta come per esempio l’emoglobina fetale. Durante l’eritropoiesi in maniera rapida nell’adulto alcuni globuli rossi ripercorrono tutta l’ontogenesi e contemporaneamente la filogenesi, perché i globuli rossi che contengono ancora il nucleo si trovano ad esempio nei rospi cioè in alcuni animali più antichi per cui evidentemente ogni giorno ripercorriamo con la produzione di un globulo rosso in maniera rapida tutta la filogenesi e tutta l’ontogenesi.

-Dove si trovano i geni che codificano per l’emoglobina? Prima di tutto c’è da dire che essendo geni molto importanti la natura li preserva grazie al fenomeno della duplicazione (a volte si può anche duplicare il duplicato) e così noi oggi abbiamo molti geni che producono per globine che sono localizzati in due raggruppamenti detti cluster, uno sul cromosoma 16 e uno sul cromosoma 11. Sul cromosoma 16 troviamo i geni α-globinici. Esso è composto da geni α1 e α2 che però non producono tutti e due allo stesso modo, uno lavora di più e l’altro lavora di meno: α2 lavora al 25% e α1 al 75%. Questo ha delle conseguenze nel caso di mutazioni perché ovviamente c’è differenza tra la mutazione del gene α2 rispetto al gene α1, la rilevanza quantitativa è diversa ed è maggiore in α1. Esistono all’interno del cluster anche degli pseudogeni cioè dei geni che erano una volta funzionali, millenni e millenni fa, ma che nel tempo hanno acquisito delle mutazioni per cui ora non funzionano più (nel caso ad esempio della 21-idrossilasi come visto nella lezione precedente e di come erano rilevanti poi nella patogenesi del meccanismo molecolare), abbiamo poi il gene ζ(zeta) che è la controparte durante la vita embrionale del gene α e molto più a monte abbiamo la cosiddetta LCR (locus control region) cioè il centro di controllo dello Switch delle globine cioè il centro che permette l’accensione e lo spegnimento dei geni in maniera sequenziale. Geni che si accendono in maniera sequenziale sono sintenici cioè si trovano uno dopo l’altro in direzione 5’-3’ sullo stesso cromosoma e infatti il meccanismo della loro accensione è il seguente: la LCR che è molto distante si piega, fa un’ansa e tocca prima, durante la vita embrionale, il promotore dei geni ζ così viene trascritta la globina ζ e si forma emoglobina embrionale, andando avanti nella differenziazione il LCR si stacca da ζ che si spegne, il promotore viene ipermetilato, quindi spento, e invece tocca i promotori dei due geni α1 e α2 e si accende la sintesi di queste globine che continua per tutta la vita.

Abbiamo poi l’altro cluster, quello della componente non α, su un altro cromosoma. Tutto il cluster è circa 50kbasi quindi 50.000 basi; il gene delle globine non è grande, è circa 1800 basi, è un gene piccolo. Abbiamo un’altra LCR, abbiamo uno pseudoβ2 che quindi non funziona più, poi abbiamo i geni ε, gγ aγ quindi prodotti durante la vita fetale, ma un pochino anche durante la vita adulta, poi un altro pseudogene, poi abbiamo β e δ. Come voi vedete anche in questo caso δ e β non funzionano alla stessa maniera anzi la

differenza tra δ e β è più rilevante rispetto a quella tra α1 e α2 perché δ produce il 2,5% della produzione, il β produce il 97% invece. Conseguenza: se viene colpito da mutazione il gene δ, non è importante perché la produzione è minima, se invece ci fosse una mutazione sul gene β la produzione sarebbe praticamente bloccata quindi le conseguenze sarebbero molto molto più gravi. Diciamo che una δ-talassemia è irrilevante rispetto ad una β-talassemia. Questi geni derivano tutti da un gene ancestrale, un piccolo gene comune a tutti quanti che si è duplicato e poi diversificato. Tanto più i due geni sono simili tra di loro per struttura ad esempio gγ e aγ che hanno un solo amminoacido di differenza, tanto più recente è la loro duplicazione. Tanto più è differente la loro sequenza, tanto più è antica la loro duplicazione, per cui possiamo dire che dal confronto tra similitudini di sequenze possiamo ricavare l’origine di questi geni.

La LCR, sia nel caso dei geni α che di quelli non α, controlla l’accensione e lo spegnimento dei geni.

Durante la vita embrionale si ripiega e tocca il promotore di ε e lo attiva, durante la vita fetale tocca il promotore di gγ e aγ e li attiva, durante la vita adulta tocca il promotore di δ e β e li attiva. Per cui è evidente che questo centro di controllo è di estrema rilevanza perché se c’è una β-talassemia il gene β non funziona ma il gene β è irrilevante durante la vita fetale quindi durante la vita fetale non avremo alcuna patologia visto che durante la vita fetale è rilevante la sintesi di γ, la patologia comparirà quindi solo al terzo mese di vita. Però se noi potessimo bloccare il LCR e non farlo andare avanti, potremmo continuare a produrre emoglobina fetale. Questo fenomeno esiste in natura, esistono degli individui che continuano a produrre emoglobina fetale anche in età adulta. Questa condizione è nota come Persistenza Ereditaria di Emoglobina Fetale e viene indicata con la sigla HPFH. Sono individui che hanno mutazioni della LCR o di geni aγ e gγ per cui continuano a produrre emoglobina fetale anche durante la vita adulta. Perché l’emoglobina fetale è importante? È funzionale all’intervallo di tempo che è la vita fetale. Perché l’emoglobina fetale è prodotta nel feto e a livello placentare, deve attrarre maggiormente l’ossigeno legato all’emoglobina A della madre (toglie l’ossigeno dall’emoglobina A e se lo prende lei). Così avviene la respirazione del feto. Per cui durante la vita adulta questo meccanismo ovviamente non serve. Questi individui che hanno l’HPFH si distinguono dalla popolazione perché sono individui che hanno una quantità aumentata di emoglobina fetale, anche se è di meno rispetto a quella che troviamo nel feto (circa il 10%, però rispetto allo 0,5% degli individui normali è moltissimo). Sono individui che hanno un numero aumentato di globuli rossi (ne producono più di 6 milioni) perché siccome l’emoglobina fetale ha una maggiore affinità con l’ossigeno, a livello renale viene letto come stimolo ipossico quindi si ha una maggiore produzione di eritropoietina e quindi automaticamente una maggiore produzione di globuli rossi. Se noi potessimo indurre in un individuo affetto da Morbo di Cooley che ha due mutazioni β talassemiche in omozigosi e che non produce l’emoglobina nell’adulto, la produzione di emoglobina fetale, potrebbe vivere bene perché non avrebbe bisogno della globina β. In effetti è quello che si cerca di fare con dei tentativi farmacologici, cioè si cerca di far produrre emoglobina fetale nell’adulto, grazie ad agenti demetilanti (anche se con risultati non brillantissimi) quali l’idrossiurea che riducono la metilazione dei promotori e quindi riducono la metilazione di gγ e aγ ed aumentano la sintesi di emoglobina fetale. Dal punto di vista classificativo quindi noi possiamo distinguere le emoglobinopatie ereditarie in:  Talassemie dovute ad una produzione deficitaria di proteine (quindi è la quantità che viene ridotta). A seconda della riduzione possiamo avere una variante che è 0 ad esempio la β0-talassemia se la βglobina non viene prodotta per niente, oppure se la sintesi è ridotta ma ancora presente noi chiameremo questa variante β+.  Varianti strutturali dovute a mutazioni puntiformi di solito nella sequenza esonica che cambiano un amminoacido con un altro. Esempio HbS cioè l’emoglobina che caratterizza l’anemia a cellule falciformi o drepanocitosi. Nella HbS c’è la sostituzione di un acido glutammico con valina. Quindi abbiamo un’emoglobina che è prodotta come quantità 100%, ma che è strutturalmente anomala. 

Persistenza ereditaria dell’emoglobina fetale dovuta a difetti dello Switch dell’emoglobina quindi durante la vita adulta continua la produzione di emoglobina fetale.

A questa classificazione fa eccezione un unico esempio che è rilevante perché questa è l’emoglobina diffusa nel territorio della foce del Volturno soprattutto nella zona di Capua (14% della popolazione): l’emoglobina Lepore, che prende il nome dal cognome della prima famiglia in cui è stata diagnosticata. Che cos’è? È un’emoglobina strutturalmente anomala perché ha una globina formata per un pezzo dal gene δ e per il successivo pezzo dal gene β quindi è una chimera δ/β. Qual è il problema di questa emoglobina? L’emoglobina Lepore trasporta l’ossigeno benissimo, non ha nessun problema nel trasporto dell’ossigeno. Il problema nasce dal fatto che la prima parte del gene è il gene δ che viene prodotto solo per il 2,5%, quindi

questa globina verrà prodotta solo per il 2,5%. Quindi ha una struttura anomala essendo una chimera δ/β, ma prodotta anche in una quantità scarsissima. Per questo è l’unico esempio di emoglobinopatia talassemica. Come si forma la Lepore? Si forma per un anomalo accoppiamento tra cromatidi fratelli per cui si accoppia da una parte il gene β e di fronte sull’altro cromosoma c’è il gene δ. Avviene il crossing over all’interno di questi geni la prima parte del gene nuovo è formata da δ e l’altra parte dal gene β. Logicamente ci sarà anche l’emoglobina antilepore in cui il gene nuovo è formato dalla prima parte β e dalla seconda δ. L’antilepore non è un’emoglobina patologica perché è prodotta normalmente essendo la prima parte β, di fatti non si distingue nella popolazione, si distingue solo un individuo che ha l’emoglobina Lepore perché ha una quantità talassemica di emoglobina. Come si fa a vedere questa emoglobina Lepore? [purtroppo questa parte non sono riuscita a sbobinarla bene perché il prof faceva riferimento ad un’immagine che ho provato anche a fotografare ma si vede malissimo]. Si può vedere facilmente così come tutte le altre emoglobine se noi la sottoponiamo ad un tracciato elettroforetico dell’emoglobina. L’emoglobina è una proteina che contiene ferro per cui è una proteina colorata di rosso, se noi mettiamo un foglio di acetato di cellulosa su un buffer e mettiamo un polo positivo e un polo negativo e facciamo passare la corrente e carichiamo con un pettinino una piccola quantità di (???) cioè quello che esce dai globuli rossi e applichiamo la corrente, abbiamo la separazione in base alla carica elettrica di tutte le globine. La prima a separarsi è l’emoglobina A2 che sarà una piccola banda (2,5%), poi abbiamo (???) l’emoglobina S, Lepore che virano allo stesso punto. Come faccio a sapere se un individuo ha la Lepore o la S? La Lepore è una talassemia quindi è una macchiolina piccolisima (6/7%), invece la S è prodotta normalmente (40%). Andando avanti si vede l’emoglobina fetale perché è ancora presente una piccola percentuale nell’adulto. È interessante notare che l’emoglobina fetale è manipolabile anche normalmente perché per esempio se voi fate un prelievo ad una donna durante la sua vita, l’emoglobina fetale è lo 0,5%, se la donna è incinta e fa un prelievo nel secondo trimestre di gravidanze l’emoglobina fetale sale, diventando 2/3%. Quindi vedete come la quantità di emoglobina fetale non è proprio fissa e già normalmente manipolabile. Se per esempio in un individuo inducete uno stress emopoietico come ad un incidente, per cui una persona si fa male e perde molto sangue, nel periodo successivo, quando si riprende dall’anemia, avrà un dosaggio aumentato di emoglobina fetale arrivando anche al 5%. È evidente che i livelli di emoglobina fetale sono normalmente manipolabili oltre che farmacologicamente. Poi abbiamo più avanti l’emoglobina (???) che è un tetramero anomalo di β e l’emoglobina H e così via. Per cui l’individuo portatore di emoglobina Lepore come si distingue dalla popolazione? Perché ha l’MCV ridotto, come i portatori di β-talassemia perché se compare meno emoglobina, il globulo rosso andrà in contro a più cicli cellulari e quindi la cellulare avrà un volume più piccolo di quello normale. Se noi vediamo la distribuzione geografica delle mutazioni talassemiche in italia è la seguente:

I difetti che caratterizzano il gene β-talassemico sono più di 180. Però non tutti i 180 sono distribuiti in tutte le regioni italiane, altrimenti la diagnostica diventerebbe non difficilissima però molto costosa. I difetti sono clusterizzati, per esempio in Campania, considerando però il napoletano originale (non il napoletano di oggi che è un po’ marocchino), ha solo 5 difetti. Se noi ci trasferiamo in Sardegna, il sardo originale ha solo un difetto, perché la Sardegna è un isolato genetico, quindi in essa è molto forte l’effetto fondatore. L’unica mutazione presente in Sardegna è la β039 cioè una mutazione in cui in posizione 39 invece della codifica per un amminoacido c’è un codone di stop per cui si forma una globina di soli 38 amminoacidi (che poi in realtà non si forma proprio), quindi non si forma prodotto proteico. Invece in Campania, il napoletano originale (il casertano originale aveva anche la Lepore), aveva solo 5 mutazioni al tempo degli antichi romani, che sono: 1. β039 (come quella presente in Sardegna) 2. Mutazione IVS1-1 dove IVS vuol dire introne, 1-1 vuol dire prima posizione nucleotidica del primo introne (le globine di solito hanno solo due introni, primo e secondo) cambia l’amminoacido, questo dal punto di vista molecolare ha una conseguenza grave perché non può più avvenire lo splicing se cambiate il primo o il secondo amminoacido oppure se cambiate il penultimo o l’ultimo amminoacido quindi che chiudono l’introne lo splicing viene eliminato quindi avremo alla fine come prodotto un RNA che contiene anche un introne (che è come non avere niente). Di conseguenza questa IVS1-1 possiamo classificarla come β0. 3. Mutazione IVS1-110 forma un sito di splicing alternativo all’interno dell’introne cioè lo splicing può avvenire o normalmente o in posizione 110 quindi non sarà una β0 ma una β+. 4. Mutazione IVS1-6 riduce lo splicing di una quantità così infinitesimale che possiamo considerarla come una β++ talassemia  viene prodotta una quantità quasi simile alla norma di β-globina.

5. Mutazione IVS2-745 (745 si trova al centro del secondo introne che è un po’ più grande) sito di splicing alternativo per cui si ha una β+ talassemia. Noi abbiamo una distribuzione geograficamente rilevante delle talassemie, oggi però questo non è più vero perché per esempio a Milano o a Torino ci sono più talassemie che a Napoli il che è già è strano, perché ci sono stati movimenti migratori e quindi è cambiata l’epidemiologia molecolare delle talassemie. Ci sono diversi difetti che sono stati importati quindi al giorno d’oggi dobbiamo tener presente anche i difetti proveniente dal Medio Oriente ad esempio o del Sud Est asiatico che prima non erano rilevanti. Perché l’emoglobina Lepore si trovava e si trova in grande quantità in corrispondenza della foce del Volturno? Perché quella zona così come altre zone dell’Italia (foce del Po, basso Lazio), circa due secoli fa, era un’area dove era diffusa la Malaria e c’è un rapporto tra talassemia e malaria. Qual è questo rapporto? È il cosiddetto vantaggio selettivo. Individui portatori di β-talassemia avevano un vantaggio selettivo rispetto alla malaria. Cioè si ammalavano meno di malaria, perché il plasmodio non riusciva ad avere un ciclo cellulare all’interno del globulo rosso talassemico per cui l’individuo porta...