Método de Sanger PDF

Preview

Summary

Download Método de Sanger PDF

Description

Estrada Neria Tessa Michelle 3FV2

Método de Sanger. ¿En qué consiste? El método de Sanger, conocida también como el método de secuenciación enzimática, es una técnica que basa en la interrupción controlada de la replicación del ADN con ayuda de didesoxinucleótidos. Se parte de un fragmento de DNA, previamente desnaturalizada, donde se adiciona un cebador radioactivo (con fósforo 32 o algún otro isótopo de fosforo) para que se una a la secuencia de DNA, apareándose con las bases correspondientes a dicho primer, el cual iniciará la síntesis de la secuencia complementaria, realizada por la DNA sintetasa en dirección 5´3´. En este sentido, la mezcla en la que se producirá la reacción de síntesis se debe separar en 4 tubos, que deben contener la DNA polimerasa, el primer o cebador, los cuatro desoxinucleotidos usuales (dATP, dTTP, dGTP y dCTP) y uno de los 4 didesoxinucleótidos (ddATP, ddTTP, ddGTP y ddCTP), pero éste último en bajas concentraciones. La diferencia entre un desoxinucleótido (dNTP) y un didesoxinucleótido (ddNTP) es que la pentosa de la estructura de la ddNTP no tiene un grupo funcional -OH en la posición 3´ en el anillo del azúcar ,como los nucleótidos usuales, en su lugar posee un hidrógeno; por esa característica los didesoxinucleótidos, una vez que se agregan a la cadena (los ddNTP) que se está sintetizando, no puede unirse otro nucleótido y se frena la síntesis, siendo entonces el nucleótido terminal. Obtenemos de este proceso de replicación de DNA, fragmentos de cadenas de DNA de distintas longitudes. Posteriormente, los productos de reacción se siembran en pozos ubicados en un extremo de una cuba electroforética. Se les aplica a las muestras un campo eléctrico y en consecuencia de

desplazan

hacia

el

polo

positivo,

considerando que su desplazamiento está dado por el tamaño de las cadenas (cuanto más cortas sean, mayor será su desplazamiento sobre el gel de agarosa). En la técnica original se procedía a realizar una autorradiografía después de una

Estrada Neria Tessa Michelle 3FV2 electroforésis para identificar la posición de los fragmentos de DNA y así entonces identificar la secuencia de hasta 300 nucleótidos de una cadena. Sin

embargo,

se

han

hecho

modificaciones a la técnica y ahora se realiza la secuenciación automática en una sola electroforésis en gel, de tipo capilar, que consiste en hacer pasar las soluciones de los 4 tubos por un tubo estrecho que contiene una matriz de gel de poliacrilamida, al cual se somete a un campo eléctrico, donde los didesoxinucleótidos son detectados al pasar por un láser (esto gracias a que los ddNTP son marcados con colorantes fluorocromos), obteniendo la secuencia de nucleótidos. El orden en que estas cadenas atraviesan es de las más pequeñas a las más grandes. Los datos registrados por el detector consisten en una serie de picos en la intensidad de la fluorescencia, como se muestra en el cromatograma anterior. La secuencia del DNA se lee a partir de los picos en el cromatograma.

Estrada Neria Tessa Michelle 3FV2

Usos de este método. El método de secuenciación de Sanger ha sido utilizado en secuenciación de fragmentos de DNA como los de plásmidos bacterianos o en DNA copiado previamente en una PCR. Sin embargo, no se aplica para secuencias relativamente largas, ya que actualmente existen métodos más eficientes y económicas para proyectos a gran escala, como la secuenciación del genoma humano.

Función de los didesoxinucleótidos ddNTP. Como lo mencione antes, al no tener el grupo funcional -OH en la posición 3´ en el anillo del azúcar, no es posible que la DNA polimerasa continúe uniendo nucleótidos a la secuencia, ya que, en los nucleótidos normales, es en esa posición en la que se generan los enlaces fosfodiéster con el oxígeno de dicho grupo funcional. El uso de los ddNTP son clave en la técnica desarrollada por Sanger como terminadores.

Estrada Neria Tessa Michelle 3FV2

Referencias Curtis, H. S. (2008). Biología . España: Ed. Panamericana. Khan Academy. (2016). Khan Academy. Obtenido el 3 de julio de 2020 de Secuenciación de ADN:

https://es.khanacademy.org/science/high-school-biology/hs-molecular-

genetics/hs-biotechnology/a/dna-sequencing Marquéz, L. S. (Enero de 2011). Instituto nacional de ecología y cambio climático (INECC). Obtenido

el

2

de

julio

de

2020

de

Secuenciación

de

fragmentos ADN:

http://www2.inecc.gob.mx/publicaciones2/libros/710/secuenciacion.pdf Necochea, R. &. (Junio de 2004). Instituto de biotecnología-UNAM. Obtenido el 30 de junio de 2020 de MÉTODOS FISICOQUÍMICOS EN BIOTECNOLOGÍA: ÉTODOS DE SECUENCIACIÓN

DE

ÁCIDOS

NUCLÉICOS.:

http://www.ibt.unam.mx/computo/pdfs/met/secuenciacion_acidos_nucleicos.pdf...