microbiologia- semeadura e meios de cultura PDF

Preview

Summary

microbiologia tecnica para semeadura e resumo dos meios de cultura - quando utilizar e como interpretar...

Description

TUTORIA 4

1- Técnicas de semeadura

Semeadura em tubos de ensaio:

Estria sinuosa: semear com alça ou agulha bacteriológica, em zig-zag, partindo da base para a extremidade do bizel (superfície inclinada do meio). Objetivo: obtenção de intensa massa de microorganismos.

Estria Reta: semear com agulha bacteriológica, fazendo uma linha reta, com cuidado de não ferir o Agar, partindo da base para a extremidade do bizel (superfície inclinada do meio). Objetivo: obtenção de pequena massa de microorganismos.

Picada Central: semear com agulha bacteriológica, no centro do Agar. Dependendo da finalidade

o inóculo deve penetrar até 2/3 do tubo ou até o fundo deste.

Objetivo: é utilizado para verificar fermentação e motilidade em algumas técnicas.

Picada em Profundidade: semear com agulha bacteriológica, no centro do Agar. Dependendo da finalidade, o inóculo deve penetrar até 2/3 do tubo ou até o fundo deste. Objetivo: é utilizado para verificar fermentação e motilidade em algumas técnicas.

Semeadura em Placa de Petri:

Estria Simples:

→ Sinuosa: realizada em zig zag

→ Reta: estria reta

Objetivo: Essas técnicas são muito utilizadas para visualização de determinadas propriedades metabólicas, como a produção de enzimas hidrolíticas (hidrólise de substâncias do meio - gema de ovo, sangue...), e produção de pigmentos.

Estria por esgotamento: (4 quadrantes ou descontinua) estriar até 2/3 da metade da placa, girar 90°, estriar 2/3 do próximo quadrante (1/4 da placa), girar 90°, estriar mais 2/3 do próximo quadrante (1/4 da placa), girar 90° e estriar o restante do meio. Objetivo: obtenção de colônias isoladas

Semeadura quantitativa: (contínua)

consiste em distribuir o material por toda a placa, estriando

continuamente de modo que permita quantificar o número de colônias que cresceu no meio.

Spread-plate ou distensão: Transferir 0,1 ml da cultura para o meio sólido na placa e espalhar uniformemente com a própria ponta da pipeta, ou alça bacteriológica / swab / alça Drigalsky. Objetivo: obtenção de crescimento confluente, ou para contagem bacteriana. Esta técnica é muito utilizada na realização de antibiogramas.

Semeadura em meio liquido Difusão: Com a alça bacteriológica pega-se a colônia da placa ou de outro meio liquido e agita no meio de cultura.

2-Meios de cultura: (princípio, utilidade, inoculação, interpretação/coloração das colônias) •

Ágar Chocolate: PRINCIPIO: é adicionado sangue de carneiro e aquecido em altas temperaturas, promovendo a lise das hemácias, liberando hemina e hematina, componentes utilizados para o crescimento de microrganismos exigentes. UTILIDADE: crescimento de microrganismos exigentes (Haemophilus spp., Neisseria spp., Branhamella catarrhalis e Moraxella spp) INOCULAÇÃO: Estriar a superfície do meio, usando a técnica de semeadura para isolamento e incubar a 35ºC por 24 horas. INTERPRETAÇÃO: Cor original do meio: castanho escuro (chocolate). - Colônias de tamanho pequeno a médio, com pigmento amarelo: sugestivo de Neisseria spp, Branhamella catarrhalis ou Moraxella spp. - Colônias pequenas e delicadas, com pigmento creme claro: sugestivo de Haemophilus spp.

•

Ágar Thayer-Martin PRINCIPIO: É um meio destinados ao isolamento de Neisseria gonorrhoeae e Neisseria meningitidis , pois contém em sua fórmula antibióticos que inibem o crescimento de Neisserias saprófitas e outras bactérias, quando em amostras colhidas de sítios contaminados. UTILIDADE: Usado para o isolamento seletivo de Neisseria gonorrhoeae e Neisseria meningitidis, a partir do material de investigação.

•

Ágar Salmonella-Shigella PRINCIPIO: inibe crescimento de GP (contem componentes como sais de bile, verde brilhante e citrato de sódio). Possui lactose incorporado ao meio, permitindo identificar bactérias fermentadoras de glicose. Tissulfato de sódio e o citrato férrico permitem a detecção de H²S evidenciado por formação de colônias de cor negra no centro. UTILIDADE: Seleciona e isola Salmonella e Shigella.

INOCULAÇÃO: Inocular as placas e incubar por 18 a 24 horas; Se negativo após 24 horas, reincubar por mais 24 horas. INTERPRETAÇÃO: Bacterias lac +: colônias cor rosa (essas bactérias produzem fermentam a lactose produzem ácido que na presença do indicador vermelho neutro altera a coloração das colônia) -> Escherichia coli ou Klebsiella spp Bactérias lac-: colônias incolores. -> Shigella spp. Colonias cor negra no centro: produtoras de H2S -> Salmonella

•

Caldo BHI (BRAIN HEART INFUSION) PRINCIPIO: É um meio derivado de nutrientes de cérebro e coração, peptona e dextrose (carboidrato que os microrganismos utilizam para fermentação). A peptona e a infusão são fontes de nitrogênio, carbono, enxofre e vitaminas. UTILIDADE: Meio para cultivo de estreptococcos, pneumococos, meningococos, enterobactérias, não fermentadores, leveduras e fungos. Pode ser utilizado na preparação do inóculo para teste de susceptibilidade aos antimicrobianos, para realização de teste de coagulase em tubo, para teste de crescimento bacteriano a 42 e 44°C e para teste de motilidade em lâmina. INOCULAÇÃO: INTERPRETAÇÃO: Cor original do meio: amarelo claro, límpido. ƒ Positivo: presença de turvação = crescimento bacteriano. ƒ Negativo: ausência de turvação.

•

Ágar Mac Conkey PRINCIPIO: a presença de cristal violeta inibe o crescimento de GP, especialmente enterococos e estafilococos. Não é tão seletivo quanto o SS, mas é utilizado para GN. UTILIDADE: isolar BGN – enterobactérias e não fermentadoras- e verificar fermentação de lactose. INOCULAÇÃO: Inocular as placas e incubar por 18 a 24 horas; ƒ Se negativo após 24 horas, reincubar por mais 24 horas. INTERPRETAÇÃO: (rosa avermelhado) - Colônias cor de rosa: fermentadoras de lactose. - Colônias incolores: não fermentadoras de lactose. *Não há crescimento de cocos Gram positivos.

•

Ágar Sangue PRINCIPIO: meio rico que favorece o crescimento da maioria dos microrganismos. As hemácias integras no meio permitem ver o grau de hemólise, útil para diferenciar Streptococcus e Staphylococcus. UTILIDADE: utilizado para bactérias fastidiosas (exigem um meio altamente nutritivo para desenvolverse); permite verificar o grau de hemólise do microrganismo; prova de satelitismo. INOCULAÇÃO: Estriar a superfície do meio, usando a técnica de semeadura para isolamento, ao final da semeadura, deve-se furar o meio com a alça para verificar hemólise em profundidade e incubar à 35ºC 24 horas. INTERPRETAÇÃO: - Beta hemólise: presença de halo transparente ao redor das colônias semeadas (lise total dos eritrócitos). - Alfa hemólise: presença de halo esverdeado ao redor das colônias semeadas (lise parcial dos eritrócitos). - Gama hemólise (sem hemólise): ausência de halo ao redor das colônias (eritrócitos permanecem íntegros).

•

Ágar Cled (cystine lactose electrolyte deficient) PRINCIPIO: Usado para isolamento e quantificação de microrganismos presentes em amostras urina. A deficiência de eletrólitos inibe o véu de cepas de Proteus. UTILIDADE: Isolar e quantificar microrganismos Gram positivos, Gram negativos e leveduras. INOCULAÇÃO: Verificar técnica de semeadura quantitativa. INTERPRETAÇÃO: Bactérias lac+: meio amarelo

Bactérias lac-: meio verde

-Escherichia coli: colônias opacas, amarelas com ligeira cor amarelo escuro no centro, com cerca de 1,25 mm de diâmetro, as não fermentadoras de lactose colônias azuis - Espécies de Klebsiella: colônias muito mucosas, cor variável de amarelo a branco azulado - Espécies de Proteus: colônias azul translúcidas, geralmente menor que E.coli - Espécies de Salmonella: colônias planas, cor azul - Enterococcus faecalis: colônias amarelas, com cerca de 0,5 mm de diâmetro - Staphylococcus aureus: colônias amarelas, com cerca de 0,75 mm de diâmetro - Staphylococcus coagulase negativa: colônias amarelo palha e brancas - Corynebacterium: colônias pequenas e cinza - Lactobacilos: colônias pequenas e com superfície rugosa - Pseudomonas aeruginosa: colônias verdes, com superfície prateada e periferia rugosa

•

Ágar Mueller Hinton PRINCIPIO: meio que oferece condições de crescimento para as principais bactérias. UTILIDADE: realizar teste de resistência a antimicrobianos. INOCULAÇÃO: Preparar uma suspensão da bactéria a ser testada em salina 0,9% ou caldo TSB na escala 0,5 Mac Farland; mergulhar o swab na suspensão, retirar o excesso e semear na placa; Acrescentar os discos a serem testados e incubar a placa. INTERPRETAÇÃO: medir o tamanho do halo formado ao redor dos discos (sensível), se não houver a formação do halo, indica resistência aquela antibiótico.

•

Ágar Mueller Hinton Sangue PRINCIPIO: meio que oferece condições de crescimento para as principais bactérias. UTILIDADE: é o meio utilizado para testar a resistência de antibióticos de cepas Streptococcus pneumoniae e estreptococos beta-hemolíticos dos grupos A,B,C e G. INOCULAÇÃO: semelhante ao Mueller Hinton. INTERPRETAÇÃO: a cor original do meio é vermelho, leitura do tamanho da zona do diâmetro especifica para cada microrganismo.

•

Caldo GN (Gram-Negative) PRINCIPIO: Caldo de enriquecimento seletivo que inibe o crescimento da microbiota intestinal. Servem como uma etapa previa uma vez que semear as fezes diretamente no meio faz com que cresçam muitas bactérias da microbiota. UTILIDADE: Meio para enriquecimento seletivo para isolamento de Salmonella e Shigella INOCULAÇÃO: coloca-se uma pequena amostra de fezes no caldo e incuba por 8 horas, depois é feito o repique para o meio em placa. INTERPRETAÇÃO:

•

Ágar Manitol PRINCIPIO: Diferenciando as especias coagulase-negativas de Staphylococcus aureus. O cloreto de sódio em alta concentração inibe parcial ou completamente outros MO. A degradação do manitol pela produção de ácido muda a cor do meio para amarelo. UTILIDADE: isolamento de Staphylococcus spp. INOCULAÇAO: INTERPRETAÇÃO: coloração do meio rosa Colônias amarelas rodeadas por zona amarela: S. aureus. Colônias brancas rodeadas por zona vermelha: Staphylococcus coagulase negativa.

•

Ágar Teague-Hektoen. Teague: meio de cultura utilizados para isolamento de enterobactérias, não havendo crescimento bacteriano, constata-se amostra isenta de bactérias. As colônias lactose-positivas ou são negras ( azul escuro ) ou possuem centros negros com periferia transparente, ao passo que as lactose negativas são incolores. O meio é ligeiramente inibidor de bactérias Gram-positivas. Hektoen: detecta fermentação de lactose, produção de H2S e inibe o crescimento de bactérias que não sejam enterobactérias. As fermentadoras de lactose tornam-se amarelas, e as não-fermentadoras são incolores. Se produtoras de H2S produzem um precipitado preto.

3- Pesquisa de BAAR As BAAR são bactérias (Mycobacterium tuberculosis e Mycobacterium leprae) que possuem muito ácido graxo de cadeia longa (ácido glicólico) e não permitem que o corante penetre na célula (necessita do calor para abrir os poros e deixar que o corante entre), e quando coradas, esses microrganismos tem grande resistência em descorar-se, por isso chamados de álcool-acido resistentes. O método de detecção dessas bactérias é feito através da Coloraão de Ziehl-Neelsen, que consiste em colocar fucsina e aquecer na chama para que os poros se abram e o corante entre, aguardar por cinco minutos, lavar com água, lavar com álcoolácido, lavar novamente com agua e cobrir o esfregaço com azul-de-metileno, lavar com água e deixar secar.

4- Teste de Hodge Prepara-se uma solução com salina estéril e E. coli utilizando a escala 0,5 de McFarland e semear no Mueller Hinton em forma de tapete. Coloca-se os carbapenemicos (Ertapenem, Merapenem, Imipenem), a amostra do paciente é semeada perpendicular aos discos de antibiótico, utiliza-se controle positivo e negativo e as amostras do paciente. Incubar na estufa por 24 horas.

5- Teste Fenotipico para Carbapenemicos Prepara-se um tapete de bactérias com a amostra do paciente e coloca-se os discos de antibiótico (Ertapenem, Imipenem) puro e em cima dos demais discos coloca-se substancias que inativam as enzimas (cloxacilina, ácido fenilburônico, EDTA). Leva-se à estufa por 24 horas e depois faz-se a leitura do tamanho dos halos, se a diferença do halo entre o disco puro e com o bloqueador for maior que 5mm, indica que houve inativação enzimática....