Preparo de meios de cultura e técnicas microbiológicas PDF

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Relatório referente a aula pratica de Microbiologia geral...

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Universidade Federal do Tocantins Curso Engenharia de Alimentos Microbiologia Geral

Relatório da Aula Prática Nº 03 e 04- Preparo de meios de cultura e técnicas microbiológicas

Pedro Henrique Aires Dias Romilda Ramos da Silva Viviane Andrade Macedo

PROFESSOR: DRA. CLAUDIA CRISTINA AULER DO AMARAL SANTOS

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Palmas- TO 25 de maio de 2018 1. INTRODUÇÃO Para cultivar microrganismos em laboratório é necessário fornecer todos os nutrientes necessários para seu crescimento e desenvolvimento. A exigência desses nutrientes varia muito com relação aos tipos de microrganismos. Portanto, é necessário que se tenha um conhecimento a cerca dos princípios de nutrição microbiana (MANDIGAN et al., 2016). Os meios de cultura são a solução utilizada em laboratórios para cultivar e fornecer os nutrientes aos organismos em estudo. Existem diversos tipos de meios de cultura, tendo em vista as diversas exigências nutricionais, mas estes estão divididos em duas grandes classes: meios de cultura definidos, os quais são preparados de forma rigorosa pela adição de quantidades precisas de compostos químicos, portanto a composição química exata é conhecida; e os meios de culturas complexos que empregam componentes de produtos microbianos, animais ou vegetais como meios altamente enriquecidos, no qual a composição química não é exatamente conhecida. (MANDIGAN et al, 2016). O meio de cultura é composto principalmente por fontes de carbono e energia (açúcares), fósforo, sais minerais e nitrogênio. Para testes de organismos específicos, muitos outros componentes são utilizados para fabricar um meio de cultura (MEWS, 2015). Uma grande variedade de meios de cultura está disponível, desenvolvidos para isolamento e identificação de bactérias de interesse aos pesquisadores. Para o cultivo microbiano em meios sólidos utiliza-se o ágar, um polissacarídeo derivado de uma alga marinha, como agente solidificante. Os meios produzidos com ágar são geralmente

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contidos em tubos de ensaio, que quando sólidos são denominados de inclinados; e em placas de Petri (TORTORA et al, 2016). A inoculação dos microrganismos em meio de cultura é feita utilizando técnicas microbiológicas, tais como a semeadura. A maioria dos trabalhos microbiológicos são feitos a partir de cultura puras . O método de isolamento mais comum utilizado é o de esgotamento por estrias que consiste na imersão de uma alça de inoculação estéril em uma cultura mista e semeadura é feita na forma de estrias em um meio nutritivo, no qual os microrganismos são depositados. As últimas células depositadas são suficientemente afastadas para formar colônias isoladas. Essas colônias podem ser repicadas com uma alça de inoculação e transferidas para um tubo de ensaio com meio nutritivo para a obtenção de uma cultura pura contendo somente um tipo de bactéria (PELCZAR et al, 1996; TORTORA et al, 2016). Para a preparação e distribuição dos meios de cultura é extremamente necessário durante as etapas, esterilizar ou flambar seus equipamentos, para que seus resultados não sejam baseados em organismos proliferados através da falta de atenção.

2. OBJETIVOS Preparar meios de cultura para o cultivo de microrganismos in vitro. Utilizar técnicas microbiológicas para inoculação de uma cultura de microrganismos em tubo de ensaio e placa de Petri contendo meio de cultura estéril. Verificar a presença de culturas puras através da técnica de repicagem.

3. METODOLOGIA 3.1 Materiais I) Preparo de meio de cultura

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Ágar; Água destilada; Bastão de vidro; Béquer de 250 mL; Balança; Cloreto de sódio; Erlenmeyer de 250 mL; Espátula; Extrato de carne; Extrato de levedura; Papel alumínio; Papel kraft e barbante; Pipeta volumétrica; Pera; Proveta; Tubos de cultura;

II) Inoculação em meio de cultura

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Alça de Drigalsky; Alça de níquel-cromo; Bico de Bunsen; Erlenmeyer contendo ágar nutriente estéril; Estante para tubos de ensaio; Pipetador mecânico; Ponteiras estéreis descartáveis; Placa de Petri esterilizadas; Placa de Petri contendo crescimento microbiano; Tubo de ensaio contendo crescimento microbiano;

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 

Tubo de ensaio contendo caldo nutriente; Tubo de ensaio contendo ágar nutriente inclinado;

3.2 Métodos I) Preparo de meio de cultura: Para o preparo de caldo nutriente ou caldo simples pesou-se em uma balança, utilizando o papel alumínio como recipiente ,0,2g de extrato de carne, 0,2g de extrato de levedura, 0,6g de cloreto de sódio. Em um béquer de 250 mL, o volume pesado foi adicionado e dissolvido com 120 mL de água destilada. Utilizando uma pipeta, distribuiu-se 5 mL do caldo nutriente para cada tubo de ensaio, totalizando 4 tubos. A solução restante foi transferida para um erlenmeyer de 250 mL. Para o preparo do ágar nutriente, pesou-se 1,8g de ágar nutriente que foi adicionado a solução contida no erlenmeyer. Em seguida, o frasco foi levado ao micro-ondas para a completa dissolução do ágar por 1 minuto. Os tubos de ensaio e o erlenmeyer foram tampados com algodão, o erlenmeyer foi coberto com papel kraft e ambos foram esterilizados em autoclave a 121°C por 15 minutos. II) Inoculação em meio de cultura: O bico de Bunsen foi ligado para criar um ambiente asséptico de trabalho. O erlenmeyer contendo o ágar nutriente foi aquecido em micro-ondas, a boca do erlenmeyer foi flambada e o líiquido foi vertido para cada uma das placas de Petri, que permaneceram abertas próximas ao bico de Bunsen até solidificar. Utilizando a alça de níquel-cromo, seguiu-se a inoculação de tubo para tubo. A alça foi aquecida até o rubro e introduzida no tubo de ensaio contendo crescimento microbiano. Em seguida o conteúdo foi transferido para outro tubo de ensaio contendo

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caldo nutriente líquido e estéril. Ao final do procedimento, a alça foi novamente esterilizada. Com o auxílio de um pPipetador mecânico, seguiu-se a inoculação de tubo para placa de Petri, utilizando a técnica de espalhamento. Utilizando um pPipetador mecânico e ponteira esterilizada, transferiu-se 0,1 mL do tubo contendo crescimento microbiano para uma placa de Petri contendo ágar nutriente sólido e esterilizado. O volume foi dispensado no centro da placa e espalhado utilizando uma alça de Drigalsky previamente flambada e esterilizada. O espalhamento seguiu-se até que o meio sólido absorvesse todo o líquido. Para a repicagem em tubo de ensaio e placa de Petri, utilizou-se alça de níquelcromo, flambada até o rubro e posteriormente resfriada. Transferiu-se uma colônia isolada presente em uma placa de Petri contendo crescimento microbiano para um tubo de ensaio contendo ágar nutriente sólido inclinado e esterilizado, utilizando a técnica de estrias. A alça de níquel-cromo foi flambada até o rubro novamente e o procedimento foi realizado novamente, porém para uma placa de Petri contendo ágar nutriente sólido e estéril, utilizando a técnica de estrias por esgotamento.

4. RESULTADOS E DISCUSSÕES

Os tubos de cultura contendo meio líquido apresentaram turvação indicando a presença de microrganismos. Entretanto, não foi possível observar o crescimento microbiano nas placas de Petri e nos tubos de ensaio com meio de cultura inclinado devido ao aumento da temperatura da estufa e consequente liquefação do meio impossibilitanto a leitura dos dados. O ágar é um gel em temperatura ambiente, permanecendo firme até temperaturas de 65°C.5 O ágar derrete em temperaturas de

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aproximadamente 85 - 91°C, a tais temperaturas causa a morte da grande maioria das bactérias mesófilos, psicrotróficos, termófilos (TORTORA et al, 2016).

5. CONCLUSÃO

Portanto, os objetivos não foram alcançados completamente, uma vez que não foi possível a leitura dos dados das culturas presentes nas placas de Petri e tubos de ensaio contendo ágar nutriente sólido, devido a uma falha técnica durante o período de incubação, na qual houve um aumento da temperatura na estufa bacteriológica ocasionando a liquefação do meio.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS MANDIGAN, M. T et al. Microbiologia de Brock. 14. ed. Porto Alegre: ArtMed, 2016, p. 74 e 76. PELCZAR JR, M. J. Microbiologia: conceitos básicos e aplicações. V. 1, 2a Ed. São Paulo: Makron Books, 1996. TORTORA, G.J.; FUNKE, B.R.; CASE, CL. Microbiologia. 12. ed., Porto Alegre: Artmed, 2016, p. 165....