Microscopia electronica tincion negativa PDF

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Microscopia electronica tincion negativa...

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La tinción negativa es un método simple y rápido para estudiar la morfología y la estructura de muestras en partículas tales como virus, componentes celulares (por ejemplo, ribosomas), fragmentos celulares (por ejemplo, membranas) y macromoléculas aisladas (por ejemplo, moléculas de proteínas). La tinción negativa permite la determinación de formas a nivel molecular con microscopía electrónica de alta resolución. Los especímenes teñidos negativamente a menudo muestran un orden bien conservado. La razón es que, además de proporcionar contraste, las tinciones negativas conservan la estructura macromolecular y minimizan el daño por irradiación a la muestra. La tinción negativa reduce las fuerzas de tensión superficial en la interfaz aire-líquido. En ausencia de la tinción negativa, las muestras tienden a ser aplastadas sobre la película de soporte al secarse, especialmente bajo el haz de electrones. Estos efectos beneficiosos son aportados por los metales pesados utilizados como manchas negativas. De hecho, la tinción negativa no ha sido superada por ninguna otra técnica para determinar la forma, el tamaño y la estructura de la superficie de especímenes como virus y bacterias. Incluso las proteínas (proteínas globulares) se pueden estudiar fácilmente con métodos convencionales de tinción negativa. La muestra está incrustada en una mancha negativa que es un metal como el ácido fosfotúngstico (PTA). Al secarse, los átomos metálicos densos en electrones envuelven la muestra. La diferencia entre el espécimen y los átomos de metales pesados circundantes con respecto a su densidad produce el contraste necesario. La muestra parece ser ligera rodeada por un fondo oscuro de tinción seca (Fig. 7.1). El haz de electrones pasa a través de la baja densidad de electrones de la muestra, pero no a través del fondo metálico. La subestructura de la muestra se revela debido a la penetración de la mancha en sus agujeros y grietas. En otras palabras, la estructura se deduce de la distribución que la muestra impone a la mancha. La claridad del detalle del espécimen depende del grado en que la mancha permanece amorfa a medida que se seca, así como del espesor de la envoltura de tinción negativa seca. El método de tinción negativa se basa en el principio de que no hay reacción entre la mancha y la muestra. Esto se logra cuando la mancha se usa a un pH en el que la atracción entre las proteínas y la mancha es insignificante. En la tinción de POSitive, por otro lado, los átomos de metales pesados están unidos a sitios específicos en la molécula teñida. Algunas de las sales metálicas comúnmente usadas (por ejemplo, acetato de uranilo) se aplican tanto para tinción negativa como positiva. Las imágenes de especímenes exclusivamente teñidos negativamente son difíciles de lograr porque la tinción positiva es siempre una pequeña parte de estas imágenes. Los detalles del mecanismo de contraste responsable de la tinción positiva se presentan en el Cap. 6 y en otros lugares (Hayat, 1975, 1993). Muchos factores afectan la apariencia de especímenes teñidos negativamente. La forma y el tamaño de las muestras están influidos tanto por el modo de aplicación de tinción negativa como por la mancha misma. La fijación con un aldehído permite revelar los componentes internos. El pH y la concentración de la mancha, la concentración de la muestra, la temperatura, la duración de la tinción, la naturaleza de la película de soporte y el tiempo que tarda la muestra en secarse sobre la película de soporte influyen en la imagen final de la muestra. Aunque comúnmente se cree que la sal de tinción negativa forma una capa amorfa alrededor de la muestra, la presencia de microcristalitos en la capa no puede evitarse, y su posible movilidad bajo el haz de electrones no puede ignorarse. Por lo tanto, el tamaño de los cristalitos formados por la tinción negativa tiene un papel en la revelación de los

detalles estructurales de una muestra. Además, debido a que la capacidad de una tinción negativa para revelar la forma general de la muestra depende de la penetración de los cationes o aniones de tinción en las cavidades acuosas de la muestra, dicha permeación tiende a estar limitada por el diámetro del ion hidratado. Como resultado, las regiones superficiales de una muestra que contiene aminoácidos hidrófobos y cavidades hidrófobas son poco propensas a teñirse negativamente de forma óptima (Harris, 1997). Además, las regiones superficiales de la muestra que llevan una carga neta negativa o positiva interactúan de forma diferente con las manchas aniónicas o catiónicas negativas, respectivamente. Esto se ejemplifica por los cationes de uranilo que se unen a grupos fosfato y carboxilo, mientras que los aniones de molibdato secuestran calcio y magnesio unidos y también pueden interactuar con grupos amino cargados positivamente. La tinción negativa convencional de las criosecciones delgadas generalmente no produce resultados satisfactorios. La superficie de la sección tiende a contener demasiada o muy poca mancha. El método de cobertura de tinción negativa es útil para lograr una tinción negativa satisfactoria (Sakai et al., 1995). Cuando la sección está cubierta con una pieza de película Formvar, se retiene una cantidad apropiada de solución de tinción en la cuadrícula. Es necesario que la sección se coloque plana, sin arrugas o superposición, en la película de soporte. La película de cobertura debe ser lo suficientemente delgada (2030 nm) para permitir una imagen nítida y clara. El método se puede usar con una rejilla de un solo agujero de 1 mm que permite la observación de toda la sección sin obstrucción por las barras de la rejilla. El procedimiento puede completarse en unos minutos. La secuencia vertical del sistema, comenzando desde la parte inferior, es la rejilla -, -> película de soporte -> sección -> mancha ~ + película de recubrimiento. En algunos estudios, las partículas del virus se fijan con glutaraldehído antes de la tinción negativa. Sin embargo, un inconveniente de tal fijación en algunos casos es la disminución de la unión de virus a la película de soporte en la rejilla (Miller, 1997). Esto se convierte en un problema grave cuando la concentración de virus en la muestra está cerca del umbral de detección. En este caso, los números virales caerían por debajo del nivel umbral. Por lo tanto, para obtener resultados positivos en muestras, como el líquido cefalorraquídeo (LCR), que contienen un número escaso de partículas virales, se debe evitar la fijación. Otro posible obstáculo para fijar el virus simple es la aglutinación de partículas virales con contaminantes en muestras sucias, como las heces, que pueden haberse obtenido incluso de pacientes con gastroenteritis. Los virus atrapados en el grupo tienden a sedimentarse durante la centrifugación a baja velocidad. Además, los restos adheridos al virus podrían dificultar la identificación de este último. Si se está estudiando un nuevo virus, se deben examinar tanto muestras virales no fijas como fijas. Si la patogenicidad es una preocupación, la muestra viral puede fijarse después de que se haya adherido a la película de soporte. Las muestras fijas requieren lavado con agua destilada antes de tinción negativa. Alternativamente, ambos lados de la rejilla que llevan la muestra viral pueden estar expuestos a la radiación UV. Otra precaución es almacenar grillas que transporten muestras no patógenas separadas de aquellas con material potencialmente infeccioso. Se deben tomar precauciones rigurosas en el manejo de materiales infecciosos. Todas las muestras potencialmente infecciosas deben estar inactivadas. La irradiación ultravioleta mata a la mayoría de los virus. Es deseable mantener un contenedor de desinfectante (por ejemplo, solución de hipoclorito que contenga un detergente aniónico) sobre el banco de trabajo para eliminar materiales contaminados tales como papel de filtro. Para una

descripción detallada de las precauciones de seguridad requeridas para el manejo de virus humanos, se remite al lector a Hayat y Miller (1990). MECANISMO DE MANCHADO NEGATIVO La tinción negativa aumenta la dispersión de electrones como resultado de la presencia de átomos pesados introducidos en regiones hidrófilas de la muestra, mejorando así el contraste de amplitud. La mancha penetra en las regiones hidrofílicas para reemplazar el agua. Debido a que la mancha se seca más rápido que la muestra, se forma una capa de tinción cada vez más viscosa dentro de las regiones hidrófilas y alrededor de las regiones hidrófobas, incluidos los constituyentes de los lípidos. La muestra y la mancha producen diferentes dispersiones de electrones, lo que resulta en una imagen clara de la muestra y una imagen oscura de la mancha en las micrografías electrónicas. La tasa de penetración de manchas en las cavidades de un conjunto de proteínas se debe principalmente al tamaño y a la carga del ion de tinción. Los diámetros del acetato de uranilo y los iones de PTA están en los rangos 0.4-0.5 nm y 0.8-1.5 mm, respectivamente. Una molécula de PTA en agua es un anión relativamente voluminoso (PW / 12025). Además, las propiedades de la superficie de la muestra determinan la adhesión de la solución de tinción, que afecta la imagen final. Generalmente, la PTA se usa a un pH de aproximadamente 7.0, que está por encima del punto isoeléctrico (pI) de las proteínas. A este pH, tiene una carga neta negativa. Debido a que la mayoría de las proteínas están cargadas negativamente a pH 7,0 debido a su relativamente baja p1 (aproximadamente 5,0), son repelidas por la carga negativa de la PTA. No hay unión entre PTA y proteína, por lo que no se produce tinción positiva. Esta condición produce una tinción negativa. El catión de uranilo (U0?) Se usa a un pH. de aproximadamente 4.5, que está por debajo del pl de las proteínas. En este pH, U0? tiene una carga positiva neta Debido a que UO fi + está expuesto a proteínas por debajo de su pI cuando están cargadas positivamente, la carga positiva de la sal de uranilo repele la carga positiva sobre las proteínas. Esta condición también produce tinción negativa. En otras palabras, los residuos de proteína cargada repelen los aniones (PTA) así como los cationes (acetato de uranilo). Sin embargo, puede producirse un cierto grado de interacción entre los grupos cargados de la muestra y los iones de tinción (especialmente iones de uranilo), produciendo tinción positiva. Una razón para la aparición de tinción positiva con acetato de uranilo es la pequeña diferencia entre el pH de esta solución de tinción y la de la proteína en estudio. Otra razón es la fuerte afinidad del acetato de uranilo por los grupos fosfato y carboxilo en el ADN, los lípidos y algunas proteínas. Las propiedades fisicoquímicas de la muestra y la película de soporte determinan la imagen negativa. La mancha entra en contacto con dos superficies: la película de soporte y la muestra. Se pueden hacer las siguientes generalizaciones sobre el efecto de la naturaleza de la película y la superficie de la muestra sobre la distribución de la mancha (figura 7.2): las muestras hidrófilas retienen algo de mancha incluso cuando están unidas a películas hidrófobas. Las muestras hidrófobas unidas a películas hidrófobas son difíciles de teñir negativamente. Las muestras hidrofóbicas unidas a películas hidrófilas también retienen algo de tinte. Las muestras hidrófilas unidas a películas hidrofílicas retienen una considerable mancha. Debido a que solo las regiones de la muestra que están incrustadas en la tinción seca se pueden visualizar en la imagen negativa, es importante saber si la muestra completa o solo su parte inferior está incrustada en la mancha (figura 7.2). Las muestras de tamaño

pequeño, tales como partículas de adenovirus y macromoléculas aisladas, se tiñen habitualmente por arriba y por debajo. Después de que la gota de tinción se haya drenado, queda suficiente capa de tinte en la película de soporte para incrustar muestras pequeñas. Si la altura de esta película es más alta que la altura de la muestra, la tinción se produce en ambos lados. Sin embargo, esto no se puede suponer para todos los ejemplares de pequeño tamaño. Los capsómeros de adenovirus relativamente grandes (11 mm de altura) parecen teñirse solo desde abajo (Nermut, 1982). Los efectos de la carga molecular juegan un papel importante en la determinación de si una región dada de la muestra es penetrada por la mancha. Ambas interacciones electrostáticas de repulsión y contraión eliminan el límite difuso entre la tinción negativa y positiva. Estos efectos a su vez dependen de las propiedades intrínsecas de la muestra, así como de los procedimientos preparatorios utilizados. La presencia de una carga positiva o negativa fija dentro de un espécimen influye en la deposición de una mancha determinada. La presencia de una carga negativa repele las manchas aniónicas, como el tungstato y el molibdato, pero muestra afinidad por las manchas catiónicas, como las sales de uranilo. Como resultado, una muestra puede mostrar regiones accesibles a las manchas y regiones sin manchas, dependiendo del tipo de tinción utilizada. Se ha demostrado que las tinciones de uranilo catiónico penetran en el canal de conexión axial en uniones aisladas hepáticas de ratón, mientras que las manchas aniónicas de tungstato y molibdato se excluyen en gran medida porque el canal está cargado negativamente (Baker et al., 1985). ' MICROSCOPIA ELECTRÓNICA DE ALTA RESOLUCIÓN Los metales pesados densos en electrones que se usan para rodear las muestras suelen proporcionar suficiente contraste, lo que permite una información estructural detallada. Sin embargo, la resolución alcanzable de tales muestras está limitada a 2-2.5 mm. Recientemente se sugirió que se pueden obtener imágenes de mayor resolución de la estructura de la proteína mediante reactivos de átomos ligeros tales como sulfato de potasio y aluminio y tetraborato de sodio (Massover y Marsh, 1997). Estos reactivos no interrumpen la molécula de proteína y revelan su estructura con microscopía electrónica de campo brillante. Aunque los compuestos atómicos ligeros tienen una densidad más baja en estado seco que los compuestos de metales pesados, la densidad de los compuestos del átomo de luz todavía excede la de las proteínas puras (1,3 g / crn3). Con una mínima concentración descendente, los compuestos de átomos ligeros producen contraste principalmente por medio de una simple dispersión del haz de electrones transmitido (contraste de apertura). Se debería notar, TINCIÓN NEGATIVA sin embargo, los compuestos de bajo átomo muestran una mayor sensibilidad a la irradiación de electrones comparada con la exhibida por las sales de metales pesados. El uso de imágenes a baja dosis puede minimizar los efectos adversos inducidos por la radiación, como la migración de manchas bajo el haz de electrones. Otro enfoque para la microscopía electrónica de alta resolución de moléculas proteicas teñidas negativamente implica el uso de una mezcla de glucosa o trehalosa y la tinción negativa junto con imágenes de baja y baja dosis de electrones (Harris et al., 1995b; Kiselev et al. al., 1990). Esta mezcla de manchas carbohidrato negativa proporciona una capa amorfa más gruesa dentro de la cual las moléculas de proteína son libres de adoptar orientaciones variables con respecto a la película de soporte de carbono. La capa también

minimiza el aplanamiento indeseable de especímenes frágiles. La trehalosa es un protector biológico a temperaturas extremas, deshidratación e irradiación UV. El modo de campo brillante del TEM cuando se usa junto con la tinción negativa de algunas muestras no proporciona información suficiente. Por ejemplo, las proteínas delgadas que tienen una forma alargada están rodeadas por pequeñas cantidades de manchas de metales pesados y, por lo tanto, muestran un contraste insuficiente. Las proteínas estructurales esbeltas en forma de bastoncillo están muy extendidas en el sistema de microfilar del citoesqueleto de la célula eucariótica. Se puede obtener un mejor contraste de tales muestras negativamente teñidas mediante la aplicación de electrones dispersados inelásticamente, con una pérdida de energía en el uranio 04.5 borde de 115 eV, para imágenes (Winkler, 1997). Estas señales específicas de elementos mejoran notablemente el contraste entre la capa de metal pesado amorfo y la proteína. En el campo oscuro resultante de imágenes espectroscópicas de electrones (ESI), las moléculas de proteínas aparecen en un contraste inverso (es decir, como objetos oscuros sobre un fondo claro de sal de uranio). Cabe señalar que el deterioro de la imagen tiende a ocurrir con el tiempo bajo el haz de electrones. Por lo tanto, se deben obtener imágenes duplicadas de la misma muestra en condiciones mínimas de exposición al haz. PREFIXACIÓN DE LA MUESTRA Ciertos tipos de especímenes se alteran drásticamente o se dañan cuando no se fijan antes de la tinción negativa. El objetivo primario de la fijación química junto con la tinción negativa es preservar las estructuras terciaria y cuaternaria de los restos proteicos de la muestra antes de que se someta a los efectos adversos de la tinción negativa. La formación de enlaces cruzados intramoleculares e intermoleculares unidos covalentemente con glutaraldehído impone restricciones geométricas sobre la modificación estructural de la muestra durante la tinción negativa. La fijación, sin embargo, no debe formar enlaces cruzados entre partículas; de lo contrario, las estructuras de artefactos pueden aparecer en la imagen. El grado de reticulación puede controlarse mediante la regulación de la concentración del fi xivo, la duración de la fijación, el pH y otros parámetros (Hayat, 1981). " Varios tipos de virus se ven afectados de forma diferente por la fijación del glutaraldehído. Ciertos virus se conservan mejor cuando se fijan con este aldehído antes de la tinción negativa. Algunas características del virus se acentúan con la fijación sin distorsión de la estructura viral general. Los componentes internos de ciertos virus se conservan mejor y se visualizan cuando la tinción negativa sigue a la fijación. La pre fi jación facilita la penetración de la muestra por la mancha negativa cuando se necesita dicha permeación. Por ejemplo, la superficie del virus LaCrosse no fi jado parece tener un pequeño margen irregular, pero cuando el virus está prefijado, la superficie tiene perillas; se cree que esta última configuración está presente en viva. La fijación con glutaraldehído durante 3-5 minutos antes de la tinción negativa mejora la conservación de ciertos viriones con envoltura. La prefijación facilita la penetración de la mancha negativa a través de la membrana viral. Se obtienen resultados superiores cuando el virus de la coriomeningitis linfocítica se fija con glutaraldehído antes de la tinción negativa con 2% de silicotungstato. Cuando se intenta tinción negativa sin prefijación, el virus muestra distorsiones morfológicas. Los detalles estructurales del virus Uukuniemi, un virus esférico de ARN envuelto, se resuelven mejor después de una breve pre fi xación del virus con glutaraldehído al 0,7%

seguido de tinción negativa con acetato de uranilo al 1% (pH 7,0). En general, los virus de la familia Bunyaviridae y algunos miembros de la familia Togaviridae se visualizan mejor cuando la fi jación precede a la tinción negativa. Para mejorar la conservación de la forma de las cápsides del bacteriófago T2 y T4, se pueden flotar sobre acetato de uranilo saturado durante 30-40 minutos antes de la tinción negativa con acetato de uranilo al 2%. Muchos otros ejemplos de los efectos beneficiosos de la fijación sobre virus son discutidos por Hayat y Miller (1990). TINCIÓN NEGATIVA DESPUÉS DE LA TÉCNICA DE FIJACIÓN Se coloca una rejilla recubierta de carbono en una gota de una suspensión de virus. Después del tiempo de adsorción necesario, la red se transfiere a una gota de glutaraldehído al 1% en solución salina tamponada con fosfato (PBS) (pH 7,2) durante 510 minutos. Luego se coloca la grilla en 1-2 gotas de agua destilada y finalmente en una gota de colorante negativo tal como molibdato de amonio al 3% (pH 6,5). En cada paso, la rejilla se coloca con el lado de la película de soporte hacia abajo. Para una fijación rápida antes de la tinción negativa de ciertas muestras, como las bacterias, la r...