Tincion esporas PDF

Preview

Summary

Download Tincion esporas PDF

Description

UNIVERSIDAD DE LAS FUERZAS ARMADAS ESPE INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA INFORME DE LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA

Nombre: Génesis Recalde Nrc: 4861

Fecha: 2019-05-01

1. TÍTULO: Tinción y observación de esporas en las especies Escherichia coli, Bacillus subtilis y Sthapylococcus aureus; yI observación de cápsula bacteria de la especie Klebsiella pneumoniae en el laboratorio de microbiología. 2. RESUMEN Las esporas son estructuras que se generan a partir de ciertas bacterias y que le confieren la capacidad de resistir a diferentes condiciones que dificultan su supervivencia. Las cápsulas, por su parte, también otorgan a ciertas bacterias la facultad de defensa frente a procesos como la fagocitosis. En el presente informé se analizó tres especies de bacterias Escherichia coli, Bacillus subtilis y Sthapylococcus aureus y se determinó cual de ellas presentaba esporas. Además se observó la estructura de la bacteria Klebsiella pneumoniae para identificar la presencia de cápsula bacteriana. Para la identificación de esporas se tiñeron las placas con las diferenes muestras utilizando verde malaquita y calor para que el colorante pueda penetrar la pared. Posterior a esto se utilizó safranina como colorante de contraste. Para la identificación de cápsula bacteriana se realizó un frotis empleando nigrosina. Finalmente se determinó que las bacterias Bacillus subtilis fueron las únicas que presentaron esporas y que las cápsulas de Klebsiella pneumoniae no se tiñeron sino que se observaron como halos contrastados por un fondo oscuro. 3. PALABRA CLAVE: Verde malaquita, safranina, nigrosina. 4. INTRODUCCIÓN El reconocimiento de las esporas bacterianas constituye una parte importante en la microbiología y en general en el estudio de diferentes enfermedades. Esto porque algunas bacterias que presentan esporas son perjudiciales para el ambiente y para el ser humano. Además también es importante el reconociemiento de cápsulas bacterianas debido a que algunas de la bacterias más virulentas y patógenas las poseen, por lo que, su observación microcópica ha sido esencial para detectar su presencia causante de enfermedades como la meningitis. Algunas bacterias grampositivas pueden formar una estructura especial inactiva de resistencia, denominada endospora o espora. Se desarrollan dentro de células bacterianas vegetativas (por eso la denominación de endospora) de los géneros Bacillus y Clostridum entre otros. Estas estructuras son resistentes a situaciones vitales estresantes como el calor, la desecación, la radiación ultravioleta, los ácidos y los desinfectantes químicos (Pírez, 2008). Por lo anterior se determinó que su estructura interna resulta impermeable frente a algunas sustancias, por lo que para su tinción es necesario emplear calor como mordente para que el colorante penetre en su estructura.

Las esporas se forman al interior de la bacteria por un proceso llamado esporulación. Estas confieren a las bacterias una vida durante largos lapsos de tiempo. Además le otorgan a la bacteria la capacidad de resistir a altas temperaturas, lo anterior se debe a que contiene aproximadamente 15% de agua en su estructura (Schlegel, 1997). En cuanto a las cápsulas, estas propician a la bacteria defensa contra la fagocitosis y adherensia a diferentes superficies (Prescott, Harley, & Klein, 2002). A pesar de que en las bacterias, las cápsulas no son estructuras vitales, estas también ayudan a que las especies sean más virulentas (Schlegel, 1997). Para poder observar la presencia de cápsulas en bacterias es necesario realizar una tinción negativa empleando tinta china o nigrosina. Durante la tinción, la cápsula aparece como un halo claro y nítido en torno a una bacteria, delimitada por las partículas de carbón en suspensión coloidal de la tinta china, exhibiendo un nítido contraste (López, y otros, 2014). 5. OBJETIVOS • Reconocer la existencia de esporas en las especies Escherichia coli, Bacillus subtilis y Sthapylococcus aureus. • Observar la estructura de la cápsula bacteriana en la especie Klebsiella pneumoniae. • Aplicar técnicas de tinción para colorear esporas y poder observas cápsulas bacterianas. 6. HIPÓTESIS Las esporas solo se observan en la especie Bacillus subtilis y la cápsula bacteriana de la Klebsiella pneumoniae no se tiñe. 7. MATERIALES Y MÉTODOS 7.1. Observación de esporas Se realizó un frotis bacteriano de las especies Escherichia coli, Bacillus subtilis y Sthapylococcus aureus. Una vez listos los frotis, se colocó un pedazo de papel toalla del tamaño del porta objetos en cada una de las muestras, cubriendo toda la superficie del mismo. Se colocó abundante colorante verde malaquita en la superficie del porta objetos cubriendo todo el papel. Las tres placas fueron expuestas a la llama del mechero utilizando un trípode y una malla de metal. Se calentó el colorante durante cinco minutos, evitando que se seque y hierva. El colorante se agregó abundantemente para evitar que se dañe la muestra. Transcurrido el tiempo se lavaron las tres placas con abundante agua, evitando barrer la muestra. Seguidamente se secaron las placas y se colorearon con safranina durante un minuto. Se lavaron nuevamente, se secaron por presión con la ayuda de papel toalla y se observaron con el microscopio usando el lente de 100x. 7.2. Obsevación de cápsula bacteriana Para la observación de la cápsula bacteriana se realizó una tinción negativa, para ellos se lavó y desinfectó con alcohol al 70% un porta objetos. Una vez limpio el porta objetos se colocó una gota pequeña de nigrosina en el inicio de la parte esmerilada del mismo. Se esterilizó el asa bacteriana y se tomó muestra del cultivo de Klebsiella pneumoniae. Al tratarse de una muestra sólida se

homogenizó con la nigrosina evitanto barrer la muestra. Se utilizó otro porta objetos limpio y esterilizado para barrer la nigrosina con la muestra. Para ello se colocó el porta objetos en forma diagonal sobre la placa con el colorante. Se extendió por toda la superficie del porta objetos con la muestra tratando de crear una capa fina. Se observó con el microscopio utilizando el lente de 100x. 8. RESULTADOS La única especie que presentó esporas coloreadas con verde malaquita fue Bacillus subtilis. Estas pudieron observarse cerca de la bacteria (bacilo) como pequeños puntos verdes (Figura 1).

Figura 1. Esporas en la especie Bacillus subtilis.

En las especies Escherichia coli y Sthapylococcus aureus no se observó la presencia de esporas, por lo que estas bacterias solamente se adoptaron el color rosado de la safranina.

Figura 2. Sthapylococcus aureus

Figura 3. Escherichia coli

Al hacer la tinción negativa, el medio se coloreó con nigrosina (color negro) y las cápsulas bacterias de la especie Klebsiella pneumoniae pudieron observarse sin color, como puntos transparentes atravesados por la luz del microscopio.

Figura 4. Cápsula bacteriana de Klebsiella pneumoniae

9. DISCUSIÓN Las esporas son estructuras que se generan a partir de una bacteria mediante el proceso de esporulación. Estas confieren a la bacteria la capacidad de vivir por más tiempo y la facultad de transportarse de forma segura para conseguir alimento. Las endosporas se desarrollan dentro de células bacterianas vegetativas de tan sólo algunos géneros como: Bacillus y Clostridium (bacilos), y Sporosarcina (cocos) (Prescott, Harley, & Klein, 2002). Lo anterior pudo comprobarse debido a que durante la observación de las placas en el microscopio, la única especie que presenteó esporas fue la Bacillus subtilis. Además la tinción de esporas requiere de un proceso cuidadoso, debido a la composición que tienen en su estructura. Para ello se necesita el calor puesto que este modifica la permeabilidad de la endospora y permite la entrada del colorante a través de las capas externas de la endospora (Vázquez, Martín, Silóniz, & Serrano, 2010). Durante la parte experimental la tinción de esporas resultó exitosa puesto que pudieron observarse coloreadas con el verde malaquita. Para la observación de cápsulas fue necesaria la tinción negativa empleando el colorante nigrosina, también puede emplearse tinta china. Este colorante tiñe el medio y permite la observación de la cápsula como estructuras (que rodean a la bacteria) sin teñir sobre un fondo oscuro (Vázquez, Martín, Silóniz, & Serrano, 2010). Esto pudo ser observado durante la experimentación (Figura 4). Finalmente por lo mencionado anteriormente no se rechaza la hipótesis debido a que las esporas solo se observaron en en la especie Bacillus subtilis y la cápsula bacteriana de la Klebsiella pneumoniae no se tiñó, al contrario, se observó transparente en contraste con el fondo coloreado por la nigrosina. 10. CONCLUSIONES • Se reconocieron esporas en la bacteria Bacillus subtilis, teñidas de color verde. • Se observó la cápsula bacteria presente en Klebsiella pneumoniae como halos sin teñir rodeando la bacteria. • Se aplicó correctamente las diferentes técnicas de tinción debido a que las esporas si resultaron teñidas y las cápsulas si fueron observadas en el medio teñido negro por la nigrosina.

11. BIBLIOGRAFÍA Pírez,

M. (2008). Morfología y estructura bacteriana. Obtenido de http://www.higiene.edu.uy/cefa/2008/MorfologiayEstructuraBacteriana.pdf Schlegel, H. (1997). Microbiología General. Barcelona: Ediciones OMEGA, S.A. Prescott, L., Harley, J., & Klein, D. (2002). Microbiología. España: The McGraw-Hill Companies, Inc. López, L., Hernández, M., Colín, C., Ortega, S., Cerón, G., & Franco, R. (2014). Las tinciones básicas en el laboratorio de microbiología. Obtenido de https://www.medigraphic.com/pdfs/invdis/ir-2014/ir141b.pdf Vázquez, C., Martín, A., Silóniz, M., & Serrano, S. (2010). Técnicas básicas de Microbiología Observación de bacterias. Reduca (Biología), 15-30....