Practica 7. Tincion Hematoxilina- Eosina PDF

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Practica sobre la tincón de Hematoxilina-Eosina...

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Facultad de ciencias químicas Benemérita Universidad autónoma de puebla Área de análisis clínicos Laboratorio de Histología Número de practica: Practica 7 Nombre de la TINCION HEMATOXILINA-EOSINA practica: Integrantes: 1. Balbuena Morales Sofia Giselle 2. Bonilla Gutiérrez Brenda Verónica 3. Valencia Cartas Diana 01 de noviembre /13 de noviembre Fecha de realización/fecha de entrega: Notas del profesor:

PRACTICA 7. TINCION HEMATOXILINA-EOSINA OBJETIVOS Conocer el principio de la tinción. Así como los problemas que se presentan al realizarla. INTRODUCCIÓN Esta es una tinción empleada rutinariamente para la interpretación de los tejidos, la razón por lo que la emplean es que tiene una variedad de matices rosados y rojos que provoca la coloración con eosina, a lo que se une la excelente definición nuclear que da la hematoxilina. Este método consta de una fase inicial, en la que se van a colorear los núcleos celulares con la hematoxilina y una fase interior de contraste citoplasmático y de los componentes extracelulares con la eosina. Esta coloración generalmente se usa como base ya que el 90 % de los diagnósticos se hacen con este método, el producto final depende mucho de la destreza del Q.F.B, Histotecnólogo, Técnico de laboratorio y los colorantes en uso. La hematoxilina es uno de los colorantes usados en la tinción de Hematoxilina-Eosina (H&E). Es un colorante natural el cual se extrae del palo de Campeche, este al ser combinado con sales de aluminio, hierro, cobre y tungsteno, tiene excelentes propiedades para teñir el núcleo.

El agente químico activo de la Hematoxilina es la Hemateína, que se forma por la oxidación de la hematoxilina, este proceso de oxidación ó maduración ocurre cuando la Hematoxilina se deja en reposo por algunos días o semanas después de añadir el oxidante (yodato de sodio) Basado en las concentraciones del colorante, las hematoxilinas están clasificadas en regresivas y progresivas. La Hematoxilina de Harris se utiliza en el método regresivo, el cual consiste en teñir y luego someterlo a un proceso de decoloración controlada en alcohol ácido. El otro método es el progresivo, usando la Hematoxilina de Mayer, el cual consiste en teñir todas las estructuras del tejido y luego someterlo a una diferenciación con solución amoniacal o con carbonato de litio. Para que haya uniformidad en el tejido se debe de utilizar una sola fórmula de Hematoxilina y llevar un control diario de tiempo y calidad. La Eosina es un colorante que se emplea para teñir estructuras citoplasmáticas, este colorante se puede utilizar en base acuosa o alcohólica para darles contraste al teñido nuclear de la hematoxilina. La adición de floxina a la eosina le da un contraste variado rosado (al citoplasma) a rojo vivo (músculo y colágeno) La combinación de hematoxilina con la eosina es una reacción que tiene cargas positivas y negativas. El primero es un colorante con moléculas cargadas positivamente, de naturaleza básica (basófilo) con afinidad nuclear y el segundo consta de moléculas cargadas negativamente, es acidófilo con afinidad por el citoplasma. La ventaja de la H&E es la facilidad con que se pueden decolorar y teñir otros constituyentes en los tejidos que en ese momento pueden determinar y solucionar un diagnóstico difícil. MATERIAL Y REACTIVOS Alcohol absoluto

Hematoxilina de Harris

Alcohol del 96 %

Eosina Amarillenta

Xilol Carbonato de litio

Cajas de cristal para tinción

Alcohol ácido

Portaobjetos Cubreobjetos

PREPARACIÓN DE SOLUCIONES I.- Eosina A 264 ml de alcohol 95% agregar 50 ml de Eosina al 1 % (o 10 ml al 5%) y 2 ml de ácido acético finalmente agregar agua hasta 500 ml. NOTA: Se recomienda agregar 50 ml de Floxina B al 1% (o 10 ml al 5%) para mejorar la intensidad de color. II.- Solución saturada de carbonato de litio

Solubilizar 4.0 gr Carbonato de litio en 400 ml de agua destilada. III.- Alcohol acido A 990 ml de alcohol al 70 % adicionar 10 ml de Ácido clorhídrico (HCl).

III.- hematoxilina de Harris A 50 ml de alcohol absoluto se le añade 5 gr de Hematoxilina, 10gr de sulfato de aluminio y potasio (alumbre). Se pone a disolver completamente con agitación y a calentamiento. Después se agrega 2 gr de óxido rojo de mercurio lentamente y se deja enfriar para finalmente agregar c.b.p. 1000 ml de agua destilada. NOTAS: 1.- El colorante se coloca en un frasco oscuro y está listo para usarse. 2.- Como regla general en la preparación de esta hematoxilina tiene que tomarse en cuenta que todos los componentes de la fórmula deben de agregarse en el orden establecido y deben de estar disueltos totalmente antes de agregar el siguiente.

PROCEDIMIENTO Fijación Formol al 10 %. Técnica Cortes en parafina a 5 µm. Procedimiento para teñir 1.- Desparafinar e hidratar hasta agua corriente de la llave. 2.- Hematoxilina de Harris durante 3 a 5 min. 3.- Lavar en agua corriente de la llave durante 5 min. 4.- Alcohol ácido, (diferenciar) 1 baño. 5.- Lavar en agua corriente. 6.- Carbonato de litio, (virar) 10 baños. 7.- Lavar en agua corriente. 8.- Contrastar con Eosina 10 baños. 9.- Deshidratar, aclarar y montar. Observación al microscopio RESULTADOS:

Núcleos – azules; Eritrocitos - naranja a rosa; Citoplasma – rosa; Estructuras restantes rosado a rojo (ver ejemplos de la tinción en la Figura 7

Figura 7. Secciones de parafina de 8 µm de grosor teñidas con hematoxilina y eosina. A) Vellosidades del intestino delgado. B) Detalle del epitelio del digestivo. C) Hepatocitos. D) Papila fungiforme de la lengua.

Fundamento de la técnica 1.- Desparafinar e hidratar hasta agua de la llave permite retirar la parafina y tener el tejido hidratado para permitir la impregnación de los colorantes, una mala rehidratación impide tener una correcta tinción de los componentes celulares. 2.- La hematoxilina tiñe los núcleos. 3.- Se lava en agua para quitar el colorante. 4.- Lavar el exceso de alcohol ácido. Esto permite una diferenciación ya que esta solución remueve el colorante de ciertos componentes tisulares que son propensos a teñirse más fácil y rápidamente que otros. De esta manera se puede lograr acentuar una estructura que retiene el tinte con un alto grado de selectividad. 5.- El carbonato de litio vira las secciones de tejido teñidas con hematoxilina de color morado a azul. 6.- Se quita el exceso de carbonato de litio con un lavado y agua. 7.- Se Contrasta utilizando la Eosina, aquí se tiñen las estructuras citoplasmáticas. 8.- Después se deshidrata la muestra por medio de alcoholes de menor a mayor concentración y esta consiste en separar el agua de las preparaciones histológicas, pero también al mismo tiempo que se va deshidratando se va lavando el exceso de colorante de contraste.

9.- El aclaramiento se efectúa en xilol, aquí los cortes deben de aparecer claros y además permite la infiltración de los tejidos por la solución de montaje. 10.- El propósito del montaje es preservar el tejido teñido para su siguiente manejo examinación al microscopio. El cubre se une al corte por medio un agente llamado medio de montaje el cual puede ser bálsamo de Canadá o resina Entellan de Merck. Nota. - Las causas debidas a una tinción inadecuada en esta técnica, pueden ser: -

Mala fijación tisular.

-

El exceso o defecto de oxidación de la Hemateína.

-

Diferenciación de coloración.

-

Emplear una hematoxilina vieja o muy baja (que este muy usada).

CONCLUSIONES  La técnica Hematoxilina-Eosina es una técnica histológica que permite identificar o diferenciar los pastes de un tejido.  Hoy en día es muy útil para estudiar los tejidos de los órganos y observar anormalidades como es el caso del cáncer cérvico uterino (Papanicolau).  En el estudio de la anatomía animal es muy importante ya que permite observar los tejidos de los diferentes órganos y diferenciar las estructuras de los tejidos.

Tinción general HE. Una de las tinciones más comúnmente usada en histología es la hematoxilina-eosina nte básico (hematoxilina) y otro ras ácidas y básicas de la célula. parafina, tenemos que llevar a omoFigura es el 1.desparafinado y la Sección de un ubles.glomérulo Si partimos de deuncortes riñónde de mamífero obtenida a partir de una inclusión en parafina y teñido con hematoxilina-eosina. Los núcleos aparecen de color violáceo (hematoxilina) y el citoplasma de color

Fi gur a 2.Pas os que s es i guen dur ant e una t i nc i ón gener alde hemat o x i l i naeosi na. Los t i empos son apr oxi mat i v os por que dependen delgr os orde l osc or t esyde l a conc ent r ac i ón de l os c ol or ant es .Eldes par afinado el i mi na elmedi o de i ncl usi ón,l a par afi na.El pas oporaguadegr i f oest í pi c odel ahemat o xi l enays e denomi nadi f er enc i ac i ón.Lass al esdelaguaper mi t enobt eneruna c ol or ac i ónmásv i ol ácea,env ezdepúr pur a.Lades hi dr at ac i ónfi nal esnec es ar i apor queelmedi odemont aj enos uel eserhi dr os ol ubl e. Est osmedi osdemont aj enoaf ec t analt ej i do,nial osc ol or ant esy t i enen unaspr opi edadesópt i casex c el ent es .Además ,c onser v an l aspr epar ac i ones dur ant e años en buenas c ondi c i ones .Tr as el mont ado y s ec ado ( ev apor ac i ón delx i l eno) ,l as s ec c i ones s e

Figura 2. Pasos que se siguen durante una tinción general de hematoxilina-eosina. Los tiempos son aproximativos porque dependen del grosor de los cortes y de la concentración de los colorantes. El desparafinado elimina el medio de inclusión, la parafina. El paso por agua de grifo es típico de la hematoxilena y se denomina diferenciación. Las sales del agua permiten obtener una coloración más violácea, en vez de púrpura. La deshidratación final es necesaria porque el medio de montaje no suele ser hidrosoluble. Estos medios de montaje no afectan al tejido, ni a los colorantes y tienen unas propiedades ópticas excelentes. Además, conservan las preparaciones durante años en buenas condiciones. Tras el montado y secado (evaporación del xileno), las secciones se pueden observar con el microscopio óptico. BANCO DE PREGUNTAS Practica 7. Tinción hematoxilina-eosina

1. Investiga en se basan las siguientes técnicas de tinción, cual es el tipo de microtomia sugerido y cuál es su función: • Hematoxilina y eosina: Tinción general. Una de las tinciones más comúnmente usada en histología es la hematoxilina-eosina sobre cortes de parafina. Se usa un colorante básico (hematoxilina) y otro ácido (eosina) para teñir de diferente color a las estructuras ácidas y básicas de la célula. Antes de proceder a la tinción, si partimos de cortes de parafina, tenemos que llevar a cabo unos tratamientos previos sobre las secciones como es el desparafinado y la hidratación, puesto que estos colorantes son hidrosolubles. Si partimos de cortes de criostato esto no se lleva a cabo.

• Tinción rojo oleoso: Existen métodos como el de la “tinción con rojo oleoso “para la demostración de los lípidos “grasas neutras” en diversos tejidos, es decir, aquellas que se encuentran en el interior de las células, en forma de depósito o almacenamiento, esta técnica tiene un

fundamento físico y no químico; no se trata de técnica de coloración sino de solubilización El principio físico en que se basan en el producto de solubilidad. En efecto, si el colorante es más soluble en los componentes grasos de tejidos y células, que en el líquido en el que van disueltos, cuando la solución del colorante se ponga en contacto con el tejido habrá una transferencia de la sustancia colorante, desde la solución hacia los componentes grasos del tejido. Sumergiendo el corte en una caja Petri con agua destilada por dos minutos, posteriormente se trasladó el mismo corte a otra caja Petri que contenía alcohol de 50° por dos minutos; una vez transcurrido el tiempo se sumergió la muestra en el reactivo de rojo oleoso por un periodo de 10minutos. En seguida se lavó el tejido en alcohol de 50° por un minuto, luego entonces se realizó la tinción en hematoxilina por dos minutos y se enjuago en agua corriente por otros dos minutos. Después se viro el corte en agua amoniacal en dos segundos y se sumergió en agua destilada por dos minutos. Finalmente se montó el tejido en el agua destilada sobre un portaobjeto al que se le monto un cubreobjetos con una gota de Gelatina (Fijador de albumina). Lípidos: presentan un color rojo Núcleos: presenta un color azul • Negro de masón:

• Tinción tricromía de Masson  IMH de receptores tumorales: Esta modalidad de tinción se utiliza sobre todo para tejido conjuntivo. Las fibras de colágeno se tiñen de azul/verde, el citoplasma se vuelve rojo/rosa, los eritrocitos rojos y los núcleos se colorean en negro.

Como su nombre indica esta tinción emplea tres colorantes. Son la hematoxilina, la fucsina y la verde luz. Esta tinción es muy útil para poner de manifiesto las fibras de colágeno, y el conectivo en general, en comparación células musculares o epitelios. Se emplea mucho en la diagnosis de procesos tumorales. Hay muchas variantes de esta tinción adaptadas a las necesidades particulares de cada laboratorio. Colágeno: verde azulado, Músculo: rojo, marrón, Citoplasma: rosado, Núcleos: negro, Citoplasma: rosado.

• Impregnación argéntica: La tinción argéntica es el uso de plata (en latín, Argentum) para modificar selectivamente el color o la apariencia de un objeto. Es una técnica frecuente de tinción en histología donde se utiliza para revelar detalles extremadamente finos. Es utilizada para teñir cortes histológicos. Este tipo de tinción es importante especialmente para revelar la ubicación de proteínas (por ejemplo, colágeno tipo III) y ADN. Es utilizada para demostrar ambos tipos de sustancia tanto dentro como fuera de las células. La tinción argéntica es utilizada también en las electroforesis en gel con gradiente de temperatura en geles de poliacrilamida. Algunas células son argentafines. Estas reducen las soluciones del catión plata (Ag+) a plata metálica luego de ser fijadas con formalina. Otras células son argirofílicas, estas reducen las soluciones del catión plata a plata metálica luego de ser expuestas a un colorante que contengan un agente reductor, por ejemplo, hidroquinona o formalina. El nitrato de plata forma fosfato de plata insoluble en presencia de iones fosfato; este método es conocido como tinción de Von Kossa. Cuando se somete a un agente reductor, por lo general hidroquinona, se forma plata elemental de color negro. Este método se utiliza para el estudio de la formación de partículas de fosfato de calcio durante el crecimiento óseo.

La tinción argéntica se utiliza en microscopía óptica. Las partículas de plata metálica se depositan en las fibras de reticulina sensibilizadas y son fácilmente observables en los preparados microscópicos. La tinción argéntica tiene utilidad ayudando a revelar las fibras reticulares. La tinción argéntica es especialmente útil para resaltar la presencia de algunos microorganismos que son muy difíciles de observar por otros medios tales como Pseudomonas,2Legionella, Leptospira, Helicobacter pylori, y hongos tales como Pneumocystis y Candida. Existen varias tinciones argénticas que incorporan metenamina, entre las que se encuentran: Tinción de metenamina plata de Grocott, ampliamente utilizada para revelar microorganismos fúngicos. Tinción de Jones, una tinción de metenamina-plata-Ácido periódico de Schiff que tiñe membranas basales, permitiendo ver la membrana basal glomerular "espinada" asociada con glomerulonefritis membranosa. Tiñe las fibras reticulares y las nerviosas de color negro.

• Inmunofluorescencia: La inmunofluorescencia es una técnica de inmunomarcación que hace uso de anticuerpos unidos químicamente a una sustancia fluorescente para demostrar la presencia de una determinada molécula. Es una técnica que tiene variantes cuantitativas y cualitativas La inmunofluorescencia, como técnica de tinción, puede ser utilizada en cortes de tejidos, líneas celulares cultivadas, células individuales y secreciones que contengan células en suspensión (por ejemplo, esputo) con la finalidad de analizar la presencia y distribución de proteínas, glúcidos y moléculas pequeñas tanto de origen biológico como no. Esta técnica puede ser utilizada en combinación con otras técnicas de coloración fluorescente que no hagan uso de anticuerpos, como por ejemplo DAPI para marcar ADN. Existen varios diseños de microscopios que pueden ser utilizados para el análisis de preparados histológicos marcados por inmunofluorescencia. El más simple de

todos es el microscopio de epifluorescencia, aunque también es ampliamente utilizado el microscopio confocal. También es posible utilizar varios tipos de técnicas microscópicas de alta resolución.1 La inmunofluorescencia como técnica inmunoquímica de cuantificación se puede utilizar tanto en muestras de origen biológico como en muestras no biológicas, siempre que se encuentren en un medio favorable para la unión de los anticuerpos. En general se utiliza una solución PBS (Buffer fosfato salino) como medio de reacción. Un ejemplo de este tipo de técnicas es la FPIA. En el caso de células fijadas, dependiendo de la técnica de fijado utilizada, puede ocurrir que las proteínas de interés queden unidas por enlaces cruzados a otras proteínas, lo que puede causar tanto falsos positivos, como falsos negativos debidos a unión inespecífica. Una técnica alternativa es aprovechar la síntesis de proteínas recombinantes que contengan dominios fluorescentes, por ejemplo, dominios de la proteína verde fluorescente (GFP). Estas proteínas recombinantes funcionan como una marca interna que permite seguir todo el proceso de síntesis y localización de la proteína original en una célula viva. Existen dos tipos de técnicas de inmunofluorescencia; primaria (o directa) y secundaria (o indirecta).

• Tinción de Giemsa: La tinción de Giemsa es un tipo de coloración de muestras clínicas, basada en la mezcla de colorantes ácidos y básicos. Su creación estuvo inspirada por el trabajo realizado por Romanowsky, donde Gustav Giemsa, químico y bacteriólogo originario de Alemania, la perfeccionó agregando glicerol para estabilizar los compuestos. Los cambios generados a la técnica original de Romanowsky permitieron mejorar considerablemente las observaciones microscópicas, por lo tanto, la técnica fue bautizada con el nombre de tinción de Giemsa. Por ser una técnica sencilla de realizar, de gran funcionabilidad y económica es actualmente muy utilizada en el laboratorio clínico para frotis hematológicos, muestras de médula ósea y cortes de tejido.

La técnica de tinción de Giemsa es muy útil para estudios citológicos, ya que permite la observación de estructuras específicas de las células. Esta técnica tiñe los citoplasmas, núcleos, nucléolos, vacuolas y gránulos de las células, pudiéndose distinguir incluso finas trazas de cromatina. Los colorantes tipo Romanowsky tienen como fundamento utilizar un contraste entre colorantes ácidos y básicos, para lograr teñir las estructuras básicas y ácidas respectivamente. Como se puede observar existe una afinidad de los colorantes ácidos a teñir las estructuras básicas y viceversa. El colorante básico utilizado es el azul de metileno y sus derivados oxidados (Azure A y Azure B), mientras que el colorante ácido es la eosina. Las estructuras ácidas de las células son los ácidos nucleicos, los gránulos de los segmentados basófilos, entre otras, por tanto, serán teñidos con el azul de metileno. En este mismo sentido, las estructuras básicas de las células son la hemoglobina y algunos gránulos como los contenidos en los segmentados eosinófilos, entre otras; estos serán teñidos con la eosina. Por otra parte, debido a que el azul de metileno y el Azure se caracterizan por ser colorantes metacromáticos, estos pueden brindar una tonalidad variable a las distintas estructuras de acuerdo con la carga de polianiones que posean. Es así como la combinación estratégica de colorantes básicos y ácidos logran desarrollar un amplio espectro de colores, de acuerdo con las características bioquímicas de cada estructura,...