Practica 4 Preparacion DE Frotis Y Tincion Simple PDF

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PREPARACIÓN DE UN FROTIS Y TINCION SIMPLE ...

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PARTE UNO Métodos de tinción Actividad 1

Preparación de frotis y tinción positiva simple

Objetivos de aprendizaje 1. Preparar un frotis de células microbianas y teñirlo con una tinción positiva simple. 2. Entender las razones de usar esta tinción para observar bacterias. 3. Comparar la morfología y agrupación de las células microbianas en la tinción simple positiva.

Introducción La visualización de los microorganismos vivos puede resultar complicada, debido a su tamaño pequeño, transparencia y prácticamente la carencia de color cuando están suspendidos en un medio acuoso. Los colorantes biológicos y los procedimientos de tinción en conjunto con la microscopía de luz constituyen las principales herramientas en microbiología para estudiar las propiedades y dividir a los microorganismos en grupos específicos con propósitos de diagnóstico. El éxito de la mayoría de los procedimientos de tinción depende de la preparación de un buen frotis. Existen diversos propósitos en la preparación de un frotis. El primero es causar que las células se adhieran al portaobjetos, de manera que no puedan ser desprendidas durante los pasos de la tinción y lavados subsecuentes. El segundo propósito es importante para garantizar que no ocurra la contracción de las células durante la tinción, de otra manera podrían presentarse distorsión y artefactos. Finalmente, el tercer propósito es preparar un frotis delgado, ya que el grosor del mismo determinará la facilidad para visualizar células individuales, su agrupación o detalles de la estructura celular. Cuando existen grupos densos de células pueden aparecer manchas oscuras, como resultado de que atraparon más colorante, que debió ser removido durante el procedimiento de lavado, lo que puede conducir a resultados erróneos. El procedimiento para preparar un frotis se ilustra en la Figura 1.1. El primer paso en la preparación de un frotis bacteriano depende de la fuente de los microorganismos. Cuando la bacteria se encuentra en un medio líquido (caldos, leche, saliva, entre otros), se coloca una o dos gotas del líquido con un asa directamente en la superficie del portaobjetos limpio.

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En un medio sólido como el agar o alguna parte del cuerpo, se inicia con el depósito de una o dos gotas de solución salina fisiológica (SSF) en el portaobjetos y se usa el asa de inoculación para dispersar a los microorganismos en la SSF. Cuando las bacterias crecen en medios sólidos tienden a adherirse entre sí y deben ser dispersadas por dilución en un medio líquido, de lo contrario solo se obtendrá una mancha gruesa de bacterias. El procedimiento para fijar los frotis se fundamenta básicamente en la coagulación de proteínas de las bacterias lo que causará que éstas se adhieran a la superficie del portaobjetos. Por tanto, durante la fijación se detienen los procesos enzimáticos que provocan autolisis y se inactiva una gran parte de los microorganismos. La fijación conserva a los microorganismos con cambios o distorsión mínimos cuando son teñidos. El frotis debe secarse a temperatura ambiente, después pasarlo varias veces por la llama de un mechero Bunsen o mantenido encima de la parte alta de la misma, a una altura en la cual usted toleraría esta temperatura. De manera alternativa, el frotis podría ser fijado con calor a 60°C por 10 min o con compuestos químicos como el metanol al 95% por 1 min. Tinción simple La mayoría de las tinciones en microbiología utilizan colorantes de anilina sintética derivados del benceno. Un colorante es usualmente una sal, aunque algunos son ácidos o bases, compuesta de iones coloreados cargados. El ion coloreado es referido como un cromóforo, por ejemplo: Cloruro de azul de metileno

Azul de metileno + + ClCromóforo

Si el cromóforo es un ion positivo, como el azul de metileno, se considera un colorante básico; si el ion es negativo, entonces es un colorante ácido. La mayoría de las bacterias son teñidas cuando un colorante básico atraviesa su pared celular y se adhiere a la misma con uniones iónicas débiles, debido a su carga negativa. El azul de metileno, fucsina básica y el cristal violeta son ejemplos de colorantes básicos usados comúnmente en las tinciones simples. La tinta china, nigrosina y la eosina son considerados colorantes ácidos, los cuales no tiñen a la bacteria debido a las fuerzas de repulsión electrostáticas entre la carga del colorante y la superficie celular. Los procedimientos de tinción que emplean un colorante se denominan tinciones simples. Cuando el colorante tiñe a la célula se le llama tinción directa o positiva. En tanto, si se colorea solamente el medio que la rodea es una tinción indirecta o negativa. En ésta, la célula aparecerá como un objeto transparente contra un medio coloreado. En la tinción negativa, las células no suelen fijarse con calor o químicos, por lo que las bacterias presentan menor distorsión y puede apreciarse su tamaño y forma natural. Por tanto, es posible observar bacterias que son difíciles de teñir como los espirilos. En ocasiones, puede combinarse con la tinción positiva para observar estructuras como las cápsulas. En este caso, la cápsula será vista como un halo que rodea una célula teñida contra un medio oscuro. Las tinciones simples pueden usarse para determinar la morfología, tamaño y agrupación celular (Figura 1.2).

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Medio líquido

Medio sólido

Depositar dos asadas del medio que contenga los microorganismos en el centro del círculo

Distribuir en el área del círculo

Depositar dos asadas de solución salina fisiológica en el centro del círculo

Distribuir una cantidad pequeña del inóculo en la solución salina, ajustándose al área del círculo

Dejar secar a temperatura ambiente

Colocar el portaobjetos en la parte superior del mechero Bunsen para fijar con calor y permitir que los microorganismos se adhieran a la superficie

Figura 1.1. Preparación de un frotis bacteriano. CARRILLO LÓPEZ TANIA MONSERRAT MICROBIOLÓGIA

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Cocos, con forma esférica Diplococos

diplo=par

Estreptococos

estrepto=cadena

Estafilococos

estafilo=racimo

Tétradas

tétrada=paquetes de 4

Sarcina

sarcina=paquetes de 8

Bacilos, con forma de varilla Diplobacilos Estreptobacilos

diplo= par estrepto= cadena

Espirilos, rígidos o flexibles Vibrio

Bacilo curveado

Espirilo

Helicoidales y rígidos

Espiroquetas

Helicoidales y flexibles

Figura 1.2. Morfología y agrupación bacteriana. Materiales Cultivos Cipa hijo Reactivos Aceite de imersión Azul de metileno Cristal violeta Solución Salina Fisiológica (SSF) Equipo Microscopio de luz compuesto

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Otros materiales Asa de inoculación redonda Marcador de cera Mechero Bunsen Portaobjetos Papel seda para limpieza de lentes

Procedimiento Preparación de frotis a partir de un medio sólido (Figura 1.1.) 1. Obtener los cultivos de los microorganismos y la solución salina fisiológica (SSF). 2. Lavar un portaobjetos con jabón y agua para remover la suciedad y grasa. Limpiarlo con papel para remover el exceso de humedad y tomarlo por los bordes. 3. Escribir las iniciales del microorganismo en el lado superior izquierdo del portaobjetos con un marcador de cera. 4. Flamear un asa de inoculación redonda y dejarla enfriar. Transferir una gota de SSF mediante una asada en la parte central del lado izquierdo del portaobjetos. Si los cultivos están suspendidos en caldo, no es necesario adicionar SSF para preparar el frotis. 5. Flamear el asa de inoculación y dejarla enfriar. Tomar una cantidad pequeña del cultivo con un asa de picadura a partir de una colonia aislada, y depositarla en el centro de la gota de SSF. Dispersar el organismo sobre el área del portaobjetos mediante movimientos circulares para formar una película delgada. Flamear el asa de inoculación antes de guardar. 6. Dejar secar por evaporación del agua a temperatura ambiente. Evite aplicar calor. 7. Pasar el frotis por la parte alta de la llama del mechero Bunsen cuatro veces. Evite el calentamiento prolongado del portaobjetos porque se puede romper y el calor excesivo puede ejercer un efecto en la morfología de las células. La parte inferior del portaobjetos debe sentirse cálida al tacto con la piel de su mano. Tinción positiva simple 1. Colocar el frotis en la barra de tinción y cubrirlo con azul de metileno o cristal violeta durante 1 min (Figura 1.1). 2. Lavar con agua destilada o agua de la red municipal, escurrir y dejar secar. 3. Remover cuidadosamente el exceso de agua con papel absorbente. 4. Repetir el procedimiento con el resto de las cepas. 5. Añadir una gota de aceite de inmersión en el centro de la preparación. Observar el frotis teñido con la lente del objetivo de inmersión (100X) del microscopio compuesto. 6. Registrar sus observaciones en la sección de resultados (Figura 1.2.). 7. Desechar sus preparaciones teñidas por inmersión en solución desinfectante, puede utilizar hipoclorito de sodio al 10% (1:9) por 15 min. Lave sus portaobjetos. 8. Al concluir sus observaciones microscópicas, limpie la lente del objetivo de inmersión con papel seda. El microscopio debe almacenarse con el objetivo seco débil acomodado en su lugar, coloque su funda y regréselo al sitio de almacén. 9. Desinfectar el área de trabajo. Resultados CARRILLO LÓPEZ TANIA MONSERRAT MICROBIOLÓGIA

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1. 2. 3.

Dibuje las características de las células observadas con la lente del objetivo de inmersión. Describa la morfología y agrupación celular. Describa el color de las células teñidas.

Amplificación total_____Objetivo de inmersión 100x _____________________

Aspecto

Cepa 1

Características microscópicas de las células

Morfología celular a. Forma b. Agrupación

B Estreptobacilos Agrupados en cadenas y empalizados se tiñeron de un violeta intenso.

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ESTO PARA ENTREGAR EL LUNES 17 Actividades previas a la práctica en el laboratorio Pensamiento crítico Aplicación y análisis 1. Dibuje la trayectoria de la luz desde la fuente hasta el ojo, explicando lo que sucede a medida que pasa a través de las partes principales del microscopio.

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2. Dibuje como trabaja el lente de inmersión con y sin aceite de inmersión.

3. ¿Cómo define un frotis? Un frotis consiste en la extensión de una muestra de fluido corporal (humano o animal) sobre un portaobjetos para su análisis clínico. 4. Nombre tres colorantes básicos Cristal violeta Lugol Safranina 5. a) ¿Cuál es el propósito (s) de fijar un frotis con calor?, b) ¿Cuáles son las causas de que un colorante se adhiera a la célula bacteriana? El objetivo de dejar el frotis con calor es para la adherencia de las bacterias, en el porta objetos. La capa externa de la célula de las bacterias Gram-positivas, las cuales tienen una gruesa capa de peptidoglicano, que absorbe la tinción de Gram y retienen el cristal violeta. Las bacterias Gram-negativas tienen una bicapa lipídica gruesa en la parte exterior, que es selectivamente permeable, no todo puede pasan a través de ella, y una de esas cosas es la tinción de Gram por lo cual se tiñen con la safranina.

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6. Enliste las características de los microorganismos que pueden identificarse con el uso de una técnica de tinción simple Formas Estructuras básicas Agrupaciones Afinidad de la pared bacteriana con un solo colorante 7. Durante la realización de un procedimiento de tinción simple positiva, usted olvidó fijar su frotis de Escherichia coli con calor. En el examen microscópico, ¿Cómo esperaría diferenciar esta preparación de un frotis que fue fijado con calor? Ya que no existirá una fijación en el frotis, no se podría diferenciar estructuras o agrupaciones esperadas pues al agregar el colorante este no habría pintado ninguna estructura. Ya que la fijación es el proceso en el cual se espera mantener la arquitectura tanto estructural como química lo más inalterada posible, de tal forma que sus componentes celulares mantengan las mismas características que cuando dicho ser o tejido estaban vivos. 8. Durante el receso para el café, sus amigos derraman café en su bata de laboratorio y la tela tomó el color del café. Lo anterior ¿es resultado de una tinción biológica o simplemente es un compuesto capaz de impartir color? Explique su razonamiento. Es una tinción biológica ya que el café está dentro de la lista de colorantes más comunes a lo largo de la historia, aunque no es posible encuadrar dentro de los niveles de máxima solide tintórea o saturación cromática se ha utilizado como colorantes de telas desde hace mucho tiempo. Ya que dicho compuesto tiene un cromóforo que es la parte o conjunto de átomos de una molécula responsable de su color. Se llama colorante a la sustancia capaz de absorber determinadas longitudes, son sustancias que se fijan en otras sustancias y las dotan de color de manera estable ante factores físicos o químicos como la luz y agentes oxidantes. La fibra textil, cuando es sometida a un teñido, y se hace en solución acuosa porque esta tiende a hincharse, haciendo así que el tamaño del poro sea mayor y facilitando que el colorante penetre en la fibra.

9. Dibuje las características microscópicas de diplobacilos gruesos cuando usa los siguientes colorantes en una tinción simple:

a. Cristal violeta

b. Safranina

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c. Rojo Congo

d. Tinta china

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10. Suponga que usó un portaobjetos limpio para esta actividad práctica, y al observar su frotis teñido apreció bacterias diferentes a las que usted depositó para hacer el frotis. ¿Cuál podría ser la fuente de lo sucedido? Existen varias cuasas de contaminación externas a la hora de estar realizando un frotis entre ellas pueden ser: Manos sin desinfectar Algún tipo de papel empleado en la práctica, Los operarios sobre todo si se mantuvieron alguna conversación o falta de higiene cabello demasiado largo y sin cubrir, uñas sucias etc. Los instrumentos empleados sobre todo si eran externos al laboratorio como celular, llaves, relojes etc. El aire del laboratorio

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Esquema de conceptos Síntesis 11. Construya un esquema usando las siguientes palabras:

CONCEPTOS

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