Practica 8. OBSERVACION DE CÉLULAS SANGUÍNEAS EN UN FROTIS PDF

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Facultad de ciencias químicas Benemérita Universidad autónoma de puebla Área de análisis clínicosLaboratorio de HistologíaNúmero de practica: Practica 8Nombre de la practica: OBSERVACION DE CÉLULAS SANGUÍNEAS EN UN FROTISIntegrantes: 1. Balbuena Morales Sofia Giselle2. Bonilla Gutiérrez Brenda Verón...

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Facultad de ciencias químicas Benemérita Universidad autónoma de puebla Área de análisis clínicos Laboratorio de Histología

Número de practica: Practica 8 Nombre de la practica: OBSERVACION DE CÉLULAS SANGUÍNEAS EN UN FROTIS Integrantes: 1. Balbuena Morales Sofia Giselle 2. Bonilla Gutiérrez Brenda Verónica 3. Valencia Cartas Diana Fecha de 01 de noviembre /13 de noviembre realización/fecha de entrega: Notas del profesor:

PRACTICA 8. OBSERVACION DE CÉLULAS SANGUÍNEAS EN UN FROTIS OBJETIVO.- Aprender a diferenciar las células sanguíneas.

INTRODUCCIÓN La sangre es un tipo de tejido conectivo especial, constituido por una “sustancia” líquida que se mantiene en movimiento permanente dentro del sistema cardiovascular. La sangre está formada esencialmente por dos componentes: una sustancia intercelular líquida o plasma y elementos figurados, entre los que se encuentran los eritrocitos, hematíes o glóbulos rojos, leucocitos o glóbulos blancos y restos o fragmentos citoplasmáticos derivados de células especiales de la médula ósea, llamados plaquetas. Las funciones de la sangre son variadas y complejas como son: transporte de elementos necesarios para el funcionamiento de los distintos órganos, como oxígeno, agua y sustancias alimenticias, recolección de elementos de desecho, transporte de secreciones que regulan el funcionamiento de algunos sistemas y contribución a la defensa del organismo. La morfología de las células sanguíneas se estudia habitualmente por el método del frotis, que consiste en extensiones delgadas, homogéneas, de una gota de sangre periférica sobre un portaobjetos.

FUNDAMENTO

El tejido sanguíneo o sangre, es un tejido conjuntivo altamente especializado encargado del transporte de una serie de sustancias. La sangre es un tejido que se caracteriza por ser de consistencia liquida, tienen un rojo brillante en el interior de las arterias y color rojo obscuro cuando circula por las venas, es de consistencia ligeramente viscosa. El tejido sanguíneo está compuesto por dos partes; plasma, integrado por agua y que contiene en disolución aminoácidos, hormonas, glucosa, sales minerales, anticuerpos, urea y dióxido de carbono. Por otra parte está compuesto por células que son los eritrocitos, leucocitos y plaquetas. La sangre no solo sirve como un medio de transporte, también tiene funciones de protección, mismas que desempeñan los leucocitos, la parte celular de la sangre constantemente es renovada, aproximadamente cada 120 días, una función desarrollada por el hígado y bazo (órganos recicladores) y la medula ósea (donde se originan las células sanguíneas).

MATERIAL Y METODO Lancetas estériles

Colorante de Giemsa

Portaobjetos

Colorante de Wright

Microscopio

Colorante de May Grüenwald

NOTA: se puede sustituir la muestra por una obtenida por punción venosa y utilizando los colorantes para tinción rápida.

PROCEDIMIENTO Si elige la técnica de la lanceta estéril, pique la yema de uno de los dedos o del lóbulo de la oreja y deposite una gota en un portaobjetos limpio en uno de sus extremos, y con otro portaobjetos extienda la gota en forma horizontal (véase Figura 8). Si se utiliza sangre de punción venosa con anticoagulante, el frotis debe hacerse colocando una gota de sangre en la parte media inferior del portaobjetos, y con otro se extiende hacia arriba uniformemente la gota y se deja en contacto los dos portaobjetos deslizando lentamente el de arriba hasta que forme el extendido central. En ambos casos se deja secar al aire, se fija con metanol y se tiñe con la técnica rápida, colocando el frotis 15 segundos en el colorante A, lavando con agua, y 15 segundos en el colorante B, se lava y se seca para observar con una gota de aceite de inmersión con el objetivo de 100X.

Figura 8. Procedimiento para extendido en placa. (1) tome un portaobjetos limpio. (2) coloque una gota de la muestra sanguínea. (3) Coloque un segundo portaobjetos (portaobjeto extensor) limpio en un ángulo de 45°. (4) deslice ligeramente el segundo portaobjetos hacia atrás. (5) espere a que la gota se extienda por capilaridad. (6) deslice firmemente y rápido el segundo cubreobjetos hasta obtener un extendido fino y homogeneo. (7) secar la muestra a temperatura ambiente. (8) Si es necesario rotule su muestra.

Tinción de Giemsa La tinción de Giemsa (pr. guímsa), ideada por el alemán Gustav Giemsa, es un método habitual para el examen de frotis sanguíneos, cortes histológicos y otro tipo de muestras biológicas.

Este método tiene utilidad sobre todo para poner de manifiesto las rickettsias localizadas dentro de las células huéspedes. La coloración de Giemsa se emplea también para teñir frotis de sangre en el examen para protozoos. Se pueden emplear, como variaciones, otras coloraciones como es la técnica de citoconcentración para parásitos sanguíneos, la cual tiene un bajo coste y ofrece la posibilidad de aislar e identificar en el mismo sedimento el parásito principal, con excepción de los trofozoitos jóvenes y el Plasmodium falciparum

Fundamento Estos poliorganismos adquieren una coloración diferencial y se ven dentro del citoplasma de la célula huésped. La técnica de Giemsa está formada por varios colorantes: los tintes neutros utilizados combinan el azul de metileno, Azure A y Azure B como tintes básicos, y la eosina como tinte ácido, lo que da una amplia gama de colores. El azul de metileno y el Azure son colorantes metacromático, de ahí que muchas estructuras se tiñan de púrpura y no de azul. El pH de la solución de coloración es crítico y se debe ajustar idealmente según diversos fijadores. La gama del pH debe estar entre 6.4 y 6.9 (Ver Figura 9). Neutrófilo

Monocito

Eosinófilo Monocito

Hematíes Neutrófilo

Plaquetas

Figura 9. Morfología de células sanguíneas observada utilizando la tinción de Giemsa.

Procedimiento 1. Fije el frotis con alcohol metílico durante 5 minutos. 2. Agregue solución diluida de colorante de Giemsa recién preparada (3 gotas de colorante de Giemsa concentrada por cada ml de agua destilada) y cuente 20 minutos.

3. Lave con agua corriente. 4. Seque al aire y observe con objetivo de inmersión.

Tincion de Wright La tinción de Wright es un tipo de tinción usada en histología para facilitar la diferenciación de los tipos de células de la sangre. Se usa principalmente para teñir frotis de sangre y punciones medulares, para ser examinadas al microscopio. En citogenética se usa para teñir cromosomas, para facilitar el diagnóstico de síndromes y enfermedades. Lleva el nombre James Homer Wright, su inventor, que la obtuvo modificando la tinción de Romanowsky, en 1902. Debido a que ayuda a distinguir fácilmente las células de la sangre se convirtió en una técnica muy usada para el conteo de los glóbulos blancos, una técnica rutinaria usada cuando hay sospecha de infecciones.

Fundamento La tinción de Wright es una tinción de tipo Romanowsky. Una tinción de Romanowsky consiste en azul de metileno y sus productos de oxidación, así como eosina Y o eosina B. La acción combinada de estos colorantes produce el efecto Romanowsky que da una coloración púrpura a los núcleos de los leucocitos y a los gránulos neutrofílicos y da color rosado a los eritrocitos. Los componentes de este efecto son el azul B y la eosina Y. Las propiedades de tinción de Romanowsky dependen del enlace de los colorantes a las estructuras químicas y de las interacciones del azul B y la eosina Y. Los agrupamientos de ácidos nucleicos, las proteínas de los núcleos celulares y el citoplasma inmaduro reactivo, fijan el azul B, colorante básico. La tinción de Wright cuyo colorante está compuesto de azul de metileno (que tiñe de color azul las partes ácidas de las células) y eosina (que tiñe las partes alcalinas) disueltos en metanol (que permite la fijación de las células), adicionando a la preparación buffer de fosfatos (que rehidrata a las células después de la exposición con metanol). La eosina Y, colorante ácido, se fija a los agrupamientos básicos de las moléculas de hemoglobina y a las proteínas básicas (ver Figura 10).

Figura 10. Morfología de células sanguíneas observada utilizando la tinción de Wright.

Procedimiento 1. Cubra el frotis con un número conocido de gotas de colorante de Wright durante 2 minutos. 2. Añada el mismo número de gotas de agua destilada, mezcle y deje actuar la mezcla durante 8 minutos.

3. Lave con agua corriente. 4. Seque al aire y observe con objetivo de inmersión. Técnica de Panóptico de Pappenheim La tinción de panóptico rápido es un método de tinción diferencial que permite la observación de las células sanguíneas. Debido a la interacción entre los colorantes se pueden diferenciar los núcleos y los gránulos de color violeta. Se trata de una modificación de la tinción de Romanowsky, dando un procedimiento basado en inmersiones mucho más rápido.

Fundamento Este método de tinción diferencial es un sistema que aúna la policromía y la calidad que proporcionan los métodos clásicos (Giemsa y Wright) con una gran rapidez de ejecución (15 segundos solamente). Frente a las técnicas de tinción descritas anteriormente, donde el colorante se extendía sobre el frotis, ésta presenta la peculiaridad de ser un método de inmersión, donde el frotis se sumerge en la solución colorante durante un tiempo determinado (ver Figura 11).

Figura 11. Morfología normal de células sanguíneas teñidas con la técnica de Panóptico de Pappenheim. A la izquierda se observa neutrófilo y la a derecha un linfocito.

Procedimiento 1. Cubra el frotis con 4 gotas de colorante de May Grüenwald durante 3 minutos. 2. Añada la misma cantidad de agua destilada procurando que se mezclen y deje actuar la mezcla durante un minuto.

3. Escurra el líquido y sin previo lavado, añada solución diluida de Giemsa recién preparada, dejándola actuar durante 10 minutos. Seque y observe con objetivo de inmersión.

METODOLOGIA

Figura 2. Para la obtención de muestra capilar, se debe limpiar el área a puncionar, esto con ayuda de una torunda con alcohol, posteriormente con una lanceta estéril se punciona en la yema del dedo (índice). Una vez obtenida se deposita en un portaobjetos de forma central y en un extremo del mismo.

Figura 3. Depositada la muestra y con ayuda de otro porta objetos, se correrá la sangre a lo largo del portaobjetos donde está la gota de sangre, como se muestra en

la ilustración 3.

FiguraIlustción 4. Ejemplo de un frotis 4 Ejemplo de un frotis adecuado

Figura 4. Adición de unas gotas de alcohol metílico para su fijación

Figura 5. se tiñe con la técnica rápida, colocandoA, lavando con agua, y 15 segundos en el el frotis 15 segundos en el colorante colorante B

Figura 6. Se lavaba con agua y se deja secar un par de segundos

Figura

7.

Para

observar con una gota de aceite de inmersión con

el objetivo

de 100X.

RESULTADOS Tinción de Giemsa. Tienen como fundamento utilizar un contraste entre colorantes ácidos y básicos, para lograr teñir las estructuras básicas y ácidas respectivamente. Como se puede observar existe una afinidad de los colorantes ácidos a teñir las estructuras básicas y viceversa. El colorante básico utilizado es el azul de metileno y sus derivados oxidados (Azure A y Azure B), mientras que el colorante ácido es la eosina. Las estructuras ácidas de las células son los ácidos nucleicos, los gránulos de los segmentados basófilos, entre otras, por tanto serán teñidos con el azul de metileno. La Eosina se une a la hemoglobina, a los componentes básicos de las estructuras celulares y a los gránulos de los eosinófilos.

Los eritrocitos se observan como discos bicóncavos de un tono rosado. Linfocitos; se observan con un núcleo ovalado de color violeta. Neutrófilos; Posee gránulos que se tiñen de violeta, poseen de 3 a 6 lóbulos. Eosinofilo; Presentan núcleos bilobulados de color violeta, presenta gránulos que se tiñen de color rojo. Basófilos; El núcleo puede ser lobulado casi imperceptible por la gran cantidad de gránulos, se tiñen de color morado/azul. Monocitos; Poseen un núcleo voluminoso, poseen una cantidad limitada de gránulos y el citoplasma se exhibe una leve basofilia.

Ilustración 8 Observación de frotis sanguíneo con tinción de Giemsa a 100 aumentos, nótese la diferencia ente células sanguíneas elitroides y linfoides, estas últimas con un coloración violeta tanto por su núcleo o gránulos presentes.

DISCUSION En el estudio de los tejidos existirían una serie de dificultades técnico – visuales que impiden el reconocimiento particular de las células que conforman al tejido, debido a que cada tejido es funcionalmente diferente por lo que sus características morfológicas celulares son diferentes entre sí, sin embargo, las tinciones permiten destacar esas estructuras celulares que a simple vista no son visibles, de esta forma, se puede lograr una diferenciación entre células. Un ejemplo es la tinción usada en la diferenciación celular en el tejido sanguíneo, si bien, macroscópicamente, sabemos que la sangre es roja, asociada a los eritrocitos,

existe una menor porción blanca que corresponde a los linfocitos, mismos que no son visibles aun en una observación microscópica, por lo que la tinción de Giemsa es una de las ideales para lograr esa diferenciación celular. Cada tinción sigue un principio fisicoquímico, la tinción de Giemsa es una combinación de colores con diferentes propiedades químicas. Las estructuras celulares acidas se unirán a su conjugado básico (eosina), mientras que las estructuras básicas se unirán a su conjugado acido (azul de metileno). Brindando una serie de colores en las estructuras a destacar y con ello diferenciar los distintos tipos de células que conforman al tejido sanguíneo.

CONCLUSION Las tinciones son consideradas unas herramientas básicas y esenciales en el estudio de los tejidos ya que permiten observar estructuras celulares particulares que permiten diferenciar a todas las células de los distintos tipos de tejidos. También es importante destacar que las tinciones siguen un principio, por lo que quizás una tinción no brinde información que el analista busque, esto es posible incompatibilidad entre los componentes celulares y las propiedades químicas de la tinción. Actualmente, el analista siempre se debe responder que es lo que desea ver en una célula, con base a sus necesidades podrá encontrar la tinción ideal. En el estudio patológico, las tinciones desempeñan un papel importante en el diagnóstico, se puede saber si un paciente cursa una leucemia al detectar un número elevado de linfocitos mediante una tinción de Giemsa.

CUESTIONARIO Describe algún método para teñir al mismo tiempo el citoplasma, el núcleo, lípidos, sangre y bacterias. Tinción de Wright es una posible opción, consiste en una solución de alcohol metílico, un colorante acido (eosina) y un colorante básico (azul de metileno). Las estructuras acidas tales como los ácidos nucleicos, proteínas y el citoplasma, fijan el color azul (colorante básico) Por otra parte, las estructuras básicas como los gránulos, fijan la eosina (colorante básico). Si bien no es muy recomendada para la identificación de bacterias, es posible observar una coloración azul en algunas bacterias. Establezca cuales son las razones y cuales las posibles soluciones a los siguientes problemas durante la tinción. La coloración nuclear se muestra pálida. Es posible que el colorante o tinción no haya penetrado o no se haya dejado un periodo breve de tiempo con la tinción, otra causa puede ser un aclarado excesivo desplazando la mayoría del colorante.

La coloración del citoplasma se muestra pálida. La técnica de tinción o aclarado no fue la apropiada, es posible repetir el proceso de tinción para complementar la ausencia de colorante.

Los tejidos se observan en su conjunto pálidos Durante el tren de H&E se observa un color blanquecino antes del penúltimo xilol. El aclarado fue demasiado, una menor exposición lo evita, otra opción sería repetir la tinción La muestra se lava de los portaobjetos durante la tinción. El objetivo de lavar es retirar el exceso de colorante ya que puede opacar la muestra.

REFERENCIAS o Montalvo C (2010) Tejido sanguíneo y hematopoyesis. Histología general. México. UNAM o Gartner L (2008) Texto atlas de histología. México. Mc Graw Haill. o Pawlina W. (2015) Histología Texto y atlas. Philadelphia. Wolters Kluwer. o Stevens, A (2006) Histologia Humana. Elsevier tercera edición...