Modul 5 Uji Kuantitatif Karbohidrat II.pdf PDF

Preview

Summary

1. TUJUAN 1.1. Menentukan komposisi gula reduksi dari suatu bahan yang mengandung karbohidrat dengan metode DNS dan Nelson-Somoyogi. 2. DASAR TEORI Gula reduksi merupakan monosakarida/disakarida yang mengandung gugus aldehid atau keton bebas. DNS (Dinitrosalycilic acid) merupakan metode untuk menent...

Description

1. TUJUAN 1.1. Menentukan komposisi gula reduksi dari suatu bahan yang mengandung karbohidrat dengan metode DNS dan Nelson-Somoyogi. 2. DASAR TEORI Gula reduksi merupakan monosakarida/disakarida yang mengandung gugus aldehid atau keton bebas. DNS (Dinitrosalycilic acid) merupakan metode untuk menentukan gula reduksi dalam suatu bahan. Sampel gula pereduksi akan mengalami oksidasi sedangkan gugus NO2 pada senyawa DNS mengalami reduksi. Metode Nelson-Somogyi juga merupakan salah satu metode penentuan gula pereduksi. Namun, dasar reaksi metode ini berbeda dengan DNS. Analisa secara kuantitatif didasakan pada hukum Lambert-Beer yang menyatakan bahwa intensitas cahaya yang diserap berbanding lurus dengan konsentrasi senyawa, atau dirumuskan: A= ε x b x c, dengan ε adalah koefisien ekstingsi molar, b adalah tebal larutan (kuvet), c adalah konsentrasi larutan, dan A adalah absorban (Khopkar,1990). Metode Nelson-Somogyi merupakan metode penetapan kadar gula pereduksi, dimana prinsipnya, gula pereduksi akan mereduksi ion Cu2+ menjadi Cu+, kemudian ion Cu+ akan mereduksi senyawa arsenomolibdat membentuk kompleks warna biru kehijauan (Nelson,1944; Sadasivam dan Manickam,1996). Metode Nelson-Somogyi lebi spesifik untuk menetapkan kadar gula pereduksi pada sampel yang memiliki senyawa gula campuran di dalamnya. Reaksi yang terjadi antara reagen Cu alkalis (Cu2+) spesifik dengan gula pereduksi menjadi Cu+ (endapan merah bata) kemudian ketika ditambahkan arsenomolibdat endapan tersebut akan larut dan membentuk kompleks [AsMo4VMo8VIO40]7- berwarna biru kehjauan (Cu+ diubah menjadi Cu2+). Gula-gula non pereduksi yang telah ada didalam sampel tidak mempengaruhi reaksi yang terjadi. Metode Nelson-Somogyi menyajikan presentase total karbohidrat didalam sampel (Kautsar,2011). Dilakukan pengukuran absorbansi pada λ 540 nm yang dinilai memberikan serapan optimal dari kompleks berwarna antara kuprooksida gula dan arsenomolybdate. Reagen Nelson-Somogyi berfungsi sebagai oksidator antara kupri oksida yang bereaksi dengan gula pereduksi pada bahan dan memberuk endapan merah bata, merupakan pereaksi tembaga alkali yang mengandung Na2PO4 anhidrat dengan Kalium Natrium Tartrat (garam Rochelle). Pereaksi arsemonolybdate mengandung ammonium monolybdate H2SO4, NaHAsO4.7H2O. kadar gula dapat ditentukan dengan mengukur serapan warna kompleks dan dibandingkan dengan standar (Fauzi,1994). Adaptasi reagen tembaga (1,2) Somogyi-Sheffer-Hartmann untuk penentuan glukosa digunakan untuk metode kolorimetrik dapat digunakan

1

dengan menghilangkan iodide dan iodat dalam persiapannya karena dapat menganggu reagen warna monolibdat. KI menghambat autoreduksi tembaga karena tidak adanya hasil reagen yang tidak stabil. pereaksi mikro Somogyi yang digunakan dengan berbagai variasi reagen fosforolibdat, proporsitasitas yang baik dihasilkan pada kerapatan warna dan glukosa dari berbagai konsentrasi. Namun reagen fosfomolibdat yang tidak diinginkan banyak tertinggal dan tidak memiliki stabilitas warna yang diinginkan. Pengembangan reagen warna arsenomolibdat memberikan stabilitas dan produktifitas warna yang memuaskan sehingga memungkinkan untuk menggunakan reagen tembaga dalam prosedur fotometrik untuk secara praktek digunakan dalam prosedur titrimetric yang disesuaikan (Nelson,1944). Metode alternative yang dapat digunakan selain metode NelsonSomogyi adalah metode DNS yang lebih sederhana, sensitive, dan dapat digunakan untuk sampel dalam jumlah besar (Sadasivam dan Manickam,1996). Prinsip metode ini adalah dalam suasana alkali gula pereduksi akan mereduksi asam 3,5-dinitrosalisilat (DNS) membentuk senyawa yang akan diukur absorbansinya pada panjang gelombang 550 nm (Daud et al.,2012). Metode 3,5-dinitrosalicylic acid (DNS) melibatkan deteksi kolorimetri berdasarkan oksidasi gugus karbonil dan reaksi dengan molekul penyerap UVVis. Dalam reaksinya terjadi oksidasi gugus aldehid/keton dari gula pereduksi dan DNS tereduksi menjadi 3-amino-5-notrisalicylic acid. Banyak reaksi sampingan (seperti dekomposisi gula yang bersaing dengan jumlah/ketersediaan DNS) yang bergantung pada karakter gula pereduksi, gula yang berbeda akan menghasilkan intensitas warna yang berbeda, sehingga perlu dikalibrasi untuk tiap gula. Karena spesifitas rendah, harus ada blanko untuk hasilkan tes yang akurat dan tepat (Miller,1959). Reagen DNS mengandung 1% DNS, 0.2% fenol, 0.05% Sodium bisulfit, dan 1% Sodium hidroksida. Fenol digunakan untuk meningkatkan warna yang dihasilkan, bisulfit untuk menstabilkan warna, dan alkali berperan dalam reaksi reduksi, penambahan NaOH digunakan untuk menciptakan suasana basa agar reaksi dapat terjadi. Pemanasan sampel dengan reagen DNS hingga muncul warna merah kecoklatan dan didinginkan karena suhu dapat mempengaruhi absorbansi. Tanpa garam Rochelle yang ditambahkan setelah munculnya warna dan pendinginan, warna yang dihasilkan tidak akan stabil, selain itu juga berfungsi untuk mencegah reagen melarutkan O2. Absorbansi diukur pada λ 575 nm yang dinilai memberikan serapan paling maksimal untuk warna yang dihasilkan. Hilangnya karbohidart dapat diatas dengan sodium bisulfit dan garam Rochelle, konsentrasi sulfit yang ditambahkan jika kurang dari 0.05% menyebabkan kurva tidak linier namun jika berlebih dapat menyebabkan depresi intensitas warna. Kadar NaOH tinggi dapat berdampak pada hilangnya karbohidrat (Miller,1959).

2

3. ALAT dan BAHAN 3.1. Alat  Gelas beker 50 ml  Gelas beker 100 ml  Gelas beker 500 ml  Gelas ukur 25 ml  Gelas ukur 50 ml  Hotplate stirrer  Pipet ukur 1 ml  Pipet ukur 5 ml  Pipet ukur 10 ml  Filler  Tabung reaksi  Rak tabung 3.2. Bahan  Akuades  Glukosa  DNS  Larutan Kalium Natrium Tartrat 40%

           

Waterbath Labu ukur 25 ml Labu ukur 50 ml Labu ukur 100 ml Pengaduk kaca Sendok sungu Sendok besi Spektrofotometer Kuvet Batu didih Corong Botol akuades

    

NaOH Sodium Sulfit Lautan Nelson A Larutan Nelson B Reagen Arsenomolibdat

4. SKEMA KERJA 4.1. Penyiapan Reagen DNS 1%

1 g DNS 50 mg Sodium Sulfit

1 g NaOH 1 g NaOH

Dilarutkan dalam labu ukur 100 ml

Larutan DNS 1%

Gambar 4.1.1 Skema kerja pembuatan reagen DNS 1%.

3

20 g Sodium Potassium Tartrat 50 ml Akuades Dilarutkan dalam labu ukur 50 ml Larutan Sodium Potassium Tartrat (Garam Rochelle) 40%

Gambar 4.1.2 Skema kerja pembuatan larutan Sodium Potassium Tartrat (Garam Rochelle) 40%. 4.2. Penyiapan Kurva Standar DNS 100 g glukosa 50 ml Akuades Dilarutkan dalam labu ukur 50 ml Larutan glukosa standar (2000 µg/mL) Akuades Diencerkan Larutan glukosa 200 µg/mL

Larutan glukosa 400 µg/mL

Larutan glukosa 600 µg/mL

Larutan glukosa 800 µg/mL

Larutan glukosa 1000 µg/mL

Larutan glukosa 1200 µg/mL

Dimasukkan masing-masing 3 ml dalam tabung reaksi berbeda 3 ml Reagen DNS 1% Ditutup aluminium foil. Dipanaskan selama 5-15 menit pada suhu 90oC (sampai terbentuk warna merah kecoklatan) 1 ml Garam Rochelle 40% Didinginkan hingga suhu ruang. Diamati absorbansinya pada panjang gelombang 575 nm. Blanko: akuades + reagen DNS + garam Rochelle 40%

Gambar 4.2 Skema kerja penyiapan kurva standar metode DNS. 4.3. Penyiapan Kurva Standar Nelson-Somogyi

4

Larutan glukosa 200 µg/mL

Larutan glukosa 400 µg/mL

Larutan glukosa 600 µg/mL

Larutan glukosa 800 µg/mL

Larutan glukosa 1000 µg/mL

Larutan glukosa 1200 µg/mL

Dimasukkan masing-masing 1 ml dalam tabung reaksi berbeda 1 ml Reagen Nelson Dipanaskan dalam air mendidih selama 20 menit (hingga terbentuk endapan merah bata). Dinginkan dalam suhu ruang 1 ml Reagen Arsenomolybat Diamati absorbansinya pada panjang gelombang 540 nm. Blanko: akuades + reagen Nelson + reagen Arsenomolybat

Gambar 4.3 Skema kerja penyiapan kurva metode Nelson-Somogyi. 4.4. Pengukuran Kadar Gula Reduksi Sampel 4.4.1. Metode DNS 3 ml Sampel

Dimasukkan dalam tabung reaksi 3 ml Reagen DNS 1% Ditutup aluminium foil. Dipanaskan selama 5-15 menit pada suhu 90oC (sampai terbentuk warna merah kecoklatan) 1 ml Garam Rochelle 40% Didinginkan hingga suhu ruang. Diamati absorbansinya pada panjang gelombang 575 nm. Blanko: akuades + reagen DNS + garam Rochelle 40%

Gambar 4.4.1 Skema kerja pengukuran kadar gula reduksi dalam sampel dengan metode DNS. 4.4.2. Metode Nelson-Somogyi 1 ml Sampel

Dimasukkan dalam tabung reaksi 1 ml Reagen Nelson

Dipanaskan dalam air mendidih selama 20 menit (hingga terbentuk endapan merah bata). Dinginkan dalam suhu ruang 1 ml Reagen Arsenomolybat Diamati absorbansinya pada panjang gelombang 540 nm. Blanko: akuades + reagen Nelson + reagen Arsenomolybat

Gambar 4.4.2 Skema kerja pengukuran kadar gula reduksi dalam sampel dengan meode Nelson-Somogyi. 5. DATA HASIL PENGAMATAN dan PERHITUNGAN

5

5.1. Kurva Standar DNS Konsentrasi Glukosa Absorbansi (µg/mL) (A575) 200 0.037 400 0.123 600 0.228 800 0.318 1000 0.382 12000 0.513

A = -0.0578666666 B = 4.638571429 10-4 R2 = 0.994162205 y = A + Bx

5.2. Kurva Standar Nelson-Somogyi Konsentrasi Glukosa Absorbansi ( µg/mL) (A540) 20 0.108 40 0.285 60 0.592 80 0.617 100 0.831

A = -0.0466 B = 8.89 10-3 R2 = 0.955310821 y = A + Bx

5.3. Pengukuran Kadar Gula Reduksi Metode Pengujian DNS Nelson-Somogyi Dengan metode DNS 𝑥=

Kadar Pengenceran Sampel 100 x pengenceran 200 x pengenceran

Absorbansi 0.090 0.430

𝑦 − 𝐴 0,090 − ( −0.0578666666) = = 318,7763063 µg/mL 𝐵 4.638571429 10^ − 4

[Sampel sebenarnya] = 318,7763063 ∗ 100 𝑘𝑎𝑙𝑖 𝑝𝑒𝑛𝑔𝑒𝑛𝑐𝑒𝑟𝑎𝑛 = 31.877,63063 µg/mL Dengan metode Nelson-Somogyi 𝑥=

𝑦 − 𝐴 0,430 − ( −0.0466) = = 53,61079865 µg/mL 𝐵 8.89 10^ − 3

[Sampel sebenarnya] = 53,61079865 ∗ 200 𝑘𝑎𝑙𝑖 𝑝𝑒𝑛𝑔𝑒𝑛𝑐𝑒𝑟𝑎𝑛 = 10.722,15973 µg/mL

6. PEMBAHASAN Metode Nelson-Somogyi digunakan untuk penentuan kadar gula pereduksi dari sampel filtrate pisang yang didapatkan dari modul sebelumnya dengan 6

dasar kolorimetri dan reaksi reduksi. Pembuatan kurva standar untuk mendapatkan hubungan antara absorbansi dan konsentrasi sehingga pengukuran absorbansi larutan dapat digunakan untuk penentuan kadar gula sampel. Reagen Nelson terdiri atas 2 larutan, yaitu larutan Nelson A yang berisi Natrium karbonat, garam Rochelle, Natrium bikarbonat, dan Natrium sulfat anhidrat dalam air; sedangkan larutan Nelson B terdiri atas larutan CuSO4.5H2O dalam air dan 1-2 tetes asam sulfat pekat (Nelson,1944). Penentuan gula pereduksi dengan metode Nelson-Somogyi diawali dengan terjadinya reduksi komponen pereaksi Nelson oleh glukosa. Ion tembaga(II) dari pereaksi Nelson akan tereduksi oleh glukosa menjadi tembaga(I). Pemanasan campuran sampel dengan pereaksi Nelson dimaksudkan untuk mempercepat reaksi dan mempertegas warna yang menunjukkan adanya gula pereduksi, adanya gula pereduksi teridentifikasi dengan adanya endapan merah bata yang berasal dari tembaga(I) oksida (Cu2O) (Hafimi, 2009). Penambahan reagen Nelson bertujuan untuk mengoksidasi gua pereduksi yang ada didalam sampel, sehingga menghasilkan endapan merah bata (Cu2O). Pemanasan dilakukan untuk mempercepat reaksi. Penambahan reagen arsenomolibdat ini bertujuan agar bisa bereaksi dengan endapan kupro oksida. Pada peristiwa ini kupro oksida akan mereduksi kembali arsenomolibdat menjadi molibdene blue yang berwarna biru, warna biru inilah yang nantinya akan diukur absorbansinya dengan spektrofotometer (Nielsen, 2010). Pengukuran ansorbansi kemudian dilakukan dalam spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 540 nm (Sudarmadji et al.,1997). Pembentukan warna pada metode Nelson-Somogyi lebih sensitive dibandingkan dengan metode DNS, sehingga larutan diencerkan 10 kali lipat dari larutan yang digunakan untuk metode DNS. Dari kurva standar yang dibuat, nilai R2 sebesar 0,955310821. Nilai yang didapatkan masih belum mencapai 0,99 menunjukkan hubungan yang kurang linear. Dari pengukuran absorbansi sampel, didapatkan sampel dengan pengenceran 200 dan 1000 kali memiliki nilai absorbansi yang masuk dalam range, namun yang digunakan untuk perhitungan kadar gula pereduksi dalam sampel adalah sampel dengan pengenceran 200 kali, yaitu absorbansi sebesar 0,430. Melalui persamaan regresi didapati kadar gula peredusi dalam sampel sebelum pengenceran sebesar 10.722,15973 µg/mL. Metode DNS Reagen DNS terdiri atas 3,5-dinitrosalicylic acid yang berfungsi sebagai oksidator untuk mendeteksi adanya gugus pereduksi (gula pereduksi) pada larutan uji dan akan tereduksi menjadi 3-amino-5- nitrosalicilyc acid, yang memiliki warna merah kecoklatan sehingga bisa mengindikasikan adanya reaksi redoks dan memiliki serapan sehingga cocok untuk kolorimetri, dengan pengukuran pada λ 575 nm akan memberi serapan maksimum. Selain

7

itu ditambahkan saat mempersiapkan reagen ditambahkan sodium sulfit untuk mencegah hilangnya karbohidrat yang bisa bereaksi dengan DNS karena oksidasi oleh yang terlarut dalam larutan, sehingga seluruh gula bisa teroksidasi oleh reaksi dengan DNS dan menghasilkan perubahan warna yang mendasari kuantifikasi, dan didapat pengukuran yang tepat. Penambahan NaOH pada persiapan reagen berfungsi untuk memberi suasana basa yang penting untuk jalannya reaksi. Sebelum pengukuran absoransi, ditambahkan garam Rochelle yang berfungsi untuk menjaga kestabilan warna yang terbentuk sehingga pengukuran absorbansinya baik (Miller,1959).. Tujuan penambahan DNS untuk membentuk NO2 tereduksi an menghasilkan warna merah bata yang dapat diukur dengan spektrofotometer UV-Vis (Khairina dan Yuanita,2015). Agar proses reduksi DNS terhadap gula pereduksi berjalan cepat dan sempurna diperlukan pemanasan pada suhu 100oC selama 15 menit sehingga diperoleh pembentukan warna yang lebih intensif (Miller,1959). Dari kurva standar yang dibuat, nilai R2 sebesar 0.994162205. Dari pengukuran absorbansi sampel, didapatkan sampel dengan pengenceran 20 dan 100 kali memiliki nilai absorbansi yang berbeda, namun yang digunakan untuk perhitungan kadar gula pereduksi dalam sampel adalah sampel dengan pengenceran 100 kali, yaitu absorbansi sebesar 0,090 yang masuk dalam range kurva standar. Melalui persamaan regresi didapati kadar gula peredusi dalam sampel sebelum pengenceran sebesar 31.877,63063 µg/mL. Terdapat selisih sebesar 21.155,4709 µg/mL antara konsetrasi sampel menurut pengukuran Nelson-Somogyi dan pengukuran DNS. Metode DNS cenderung memberikan hasil yang lebih besar dari pada metode NelsonSomogyi karena reagen DNS dapat memicu hidrolisis polisakarida dalam suhu tinggi (Gusakov et al.,2011). Konsentrasi gula pereduksi rata-rata dari kedua metode ini sebesar 21.299,89518 µg/mL. Factor error yang dapat terjadi sepanjang praktikum berlangsung adalah adanya kesalahan pengenceran yang dilakukan praktikan (pengenceran yang kurang tepat), penggunaan kuvert plastic (kuvet plastic turut memberikan absorbansi), dan lamanya waktu pemanasan yang kurang tepat. 7. KESIMPULAN Kadar rata-rata gula pereduksi dalam sampel ekstrak pisang yang diujikan dengan metode DNS dan metode Nelson-Somogyi sebesar 21.299,89518 µg/mL. 8. DAFTAR PUSTAKA Cox, M.M., dan D.L. Nelson. 2008. Lehninger Principles of Biochemistry. New York: W.H. Freeman and Company.

8

Daud, M., W. Safii., dan K. Syamsu. 2012. “Biokonversi Bahan Berlignoselulosa menjadi Bioetanol menggunakan Aspergillus niger dan Saccharomyces cereviciae”. Jurnal Perennial, volume 8(2),43-51. Fauzi, M. 1994. Analisa Hasil Pangan. Jember: UNEJ. Gusakov, A.V., E.G. Kondratyeva., A.P. Sinitsyn. 2011. “Comparison of Two Methods for Assaying Reducing Sugar in the Determination of Carbohydrase Activities”. International Journal of Analytical Chemistry, Colume 2011, Article ID 283658. Hu, R., L. Lin., T. Liu., P. Ouyang., B, He., S. Liu. 2008. “Reducing Sugar Content in Hemicellulose Hydrolysate by DNS Method: A Revisit”. Journal of Biobased Materials and Bioenergy, Volume 2, Issue 2, 156161. Sand Lake City: American Scientific Pubishers. Kaustar, R.H. 2011. Kajian Hidrolisis Enzimatis Selulosa dari Alga Merah (Euchema spinosum dan Euchema cottoni) menggunakan Enzim Selulase dari Aspergilus niger. Malang: Universitas Islam Malang Kharina, A., dan L. Yuanita. 2015. “Pengaruh Variasi Lama Penyimpanan Umbi Bengkuang (Pachirhyzus erozus) terhadap Kadar Glukosa Darah Rattus norvegicus”. UNESA Journal of Chemistry, Volume 4, Nomor 1. Khopkar, S.M. 1990. Konsep Dasar Kimia Analitik. Jakarta: Universitas Indonesia. Miller, G.L. 1959. “Use of Dinitrosalicylic Acid Reagent for Determination of Reducing Sugar”. Analytical Chem. 31(3),426-428. Nelson, N., 1944. “A Photometric Adaptation of the Somogyi Method for the Determination of Glucose”. Journal Biol. Chem, 153(2), 375-379. Neilson, S.S. 2010. “Introduction to Food Analysis”. Food Analysis, 4th Edition. USA: Springer. Razak, A.R., N.K. Sumarni., dan B. Rahmat. 2012. “Optimalisasi Hidrolisis Sukrosa menggunakan Resun Penukar Kation Tipe Sulfonat”. Jurnal Natural Science, Volume 1 (1), 119-131. Rahmansyah, M., dan I.M. Sudiana. 2003. “Optimasi Analisis Amilase dan Glukanase yang Diekstrak dari Miselium Pleurotus ostreatus dengan Asam 3,5-Dinitrosalisilat”. Berk. Penel. Hayati, Volume 9, 7-12. Sadasivam, S., dan A. Manickam. 1996. Biochemical Methods, 2nd Edition. New Delhi: New Age International Limited.

9

Somogyi, M. 1951. “Note on Sugar Determination”. Journal Biol. Chem, 195 (1), 19-23. Sudarmadji, S., B. Haryono., dan Suhardi. 1997. Prosedur Analisa untuk Bahan Makanan dan Pertanian, Edisi keempat. Yogyakarta: Liberty. Tarkosova, J., dan J. Copikova. 2000. “Determination of Carbohydrate Content in Banana”. Journal Near Infrared Spectrosc, Volume 8(5),22-23.

10

Lampiran

Kurva Standar DNS 0,6

Absorbansi

0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0

200

400

600

800

1000

1200

1400

Konsentrasi Glukosa (µg/mL)

Gambar 1. Kurva standar glukosa pada metode DNS.

Kurva Standar Nelson-Somogyi Absorbansi

1

0,8 0,6 0,4

0,2 0 0

20

40

60

80

100

120

Konsentrasi Glukosa (µg/mL)

Gambar 2. Kurva standar glukosa pada metode Nelson-Somogyi.

Gambar 3. Larutan blanko, larutan standar dengan pengenceran 200, 400, 600, 800, 1000, dan 1200 µg/mL, larutan sampel dengan pengenceran 20 dan 100 kali pengenceran (berurutan dari kiri ke kanan).

11

Gambar 4. Larutan blanko, larutan standar dengan pengenceran 20, 40, 60, 80, dan 100 µg/mL, larutan sampel dengan pengenceran 200 dan 1000 kali pengenceran (berurutan dari kiri ke kanan).

Gambar 5. Pembacaan absorbansi pada glukosa standar untuk metode DNS dengan konsentrasi 200 µg/mL (gambar kiri, cell 1), 400 µg/mL (gambar kiri, cell 2), 600 µg/mL (gambar kanan, cell 2), dan 800 µg/mL (gambar kanan, cell 1).

Gambar 6. Pembacaan absorbansi pada glukosa standar untuk metode DNS dengan konsentrasi 1000 µg/mL (gambar kiri, cell 1), 1200 µg/mL (gambar kiri, cell 2), larutan sampel ekstrak pisang dengan konsentrasi 100 kali (gambar kanan, cell 3).

12

Gambar 5. Pembacaan absorbansi pada glukosa standar untuk metode NelsonSomogyi dengan konsentrasi 20 µg/mL (gambar kiri, cell 1), 40 µg/mL (gambar kanan, cell 1), 60 µg/mL (gambar kanan, cell 2), 80 µg/mL (gambar kiri, cell 4), dan 100 µg/mL (gambar kiri, cell 5).

Gambar 6. Pembacaan absorbansi pada sampel ekstrak pisang pada metode Nelson-Somogyi dengan konsentrasi pengenceran 200 kali (cell 3), dan pengenceran 300 kali (cell 2).

13...