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Necropsia en peces Capítulo 3 y 4 libro. A colour atlas of salmonid diseases (Vol. 91). Bruno, D. W., Noguera, P. A., & Poppe, T. T. (2013) Springer Science & Business Media.3: Examen post mortem y el reconocimiento de anomalías tisulares La necropsia es una parte esencial de una inv...

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Necropsia en peces Capítulo 3 y 4 libro. A colour atlas of salmonid diseases (Vol. 91). Bruno, D. W., Noguera, P. A., & Poppe, T. T. (2013) Springer Science & Business Media. 3: Examen post mortem y el reconocimiento de anomalías tisulares La necropsia es una parte esencial de una investigación sobre la salud de los peces silvestres y de piscifactoría. La información sobre las prácticas de manejo y la dieta, el historial detallado de mortalidad, los cambios en el comportamiento de los peces, el peso y la talla del stock, las prácticas de manejo (transporte reciente o anterior, clasificación o tratamientos), así como la respuesta de alimentación, son factores importantes que normalmente están disponibles con los peces de cultivo. Para los peces salvajes, también se debe recopilar la mayor cantidad de información posible y en ambos escenarios, la temperatura del agua, las características químicas y físicas deben registrarse con notas de cualquier evento concurrente o reciente que afecte a otras especies en el área. El capítulo describe los procedimientos de necropsia con referencia particular a la obtención de muestras de los tejidos más comunes recolectados para el examen histológico. 3.1 Introducción La necropsia es una parte esencial de una investigación sobre la salud de los peces silvestres y de piscifactoría. La información sobre las prácticas de manejo y la dieta, el historial detallado de mortalidad, los cambios en el comportamiento de los peces, el peso y la talla del stock, las prácticas de manejo (transporte reciente o anterior, clasificación o tratamientos), así como la respuesta de alimentación, son todos factores importantes normalmente disponibles con los peces de cultivo. Para los peces silvestres, también se debe recopilar la mayor cantidad de información posible y en ambos escenarios, la temperatura del agua, las características químicas y físicas deben registrarse con notas de cualquier evento concurrente o reciente que afecte a otras especies en el área. El capítulo describe los procedimientos de necropsia con referencia particular a la obtención de muestras de los tejidos más comunes recolectados para el examen histológico. El examen post mortem o necropsia (del griego 'nekros': 'cadáver, muerto' y 'opsis': 'ojo', 'ver'), corresponde al término autopsia cuando se realiza en el cuerpo humano, es decir,

el procedimiento médico de examinar un cuerpo con el objetivo de evaluar la causa de la muerte y las lesiones presentes. Esto se logra a través de un enfoque sistemático y la observación de estructuras, órganos o tejidos externos e internos, con la ayuda de la recolección de muestras para su posterior análisis. La necropsia juega un papel importante en la investigación de la salud de los peces silvestres y de piscifactoría, tanto a nivel individual como a nivel de población. La evaluación de la salud de los peces comienza cuando el pez está vivo en su hábitat, cuando se pueden hacer observaciones importantes que cubren aspectos relacionados con los signos clínicos, el agua y el medio ambiente. En condiciones de cultivo, la información sobre prácticas de manejo y dieta también adquiere especial relevancia. Deben determinarse los registros del número o la mejor estimación de los individuos afectados dentro de la población para establecer la tasa de morbilidad y el patrón de propagación de la enfermedad o anormalidad observada. Si la enfermedad está asociada con la mortalidad, se requiere un historial detallado de la mortalidad diaria y total, teniendo en cuenta la edad, la clase y el origen del stock. Se deben tener en cuenta los cambios en el comportamiento de los peces, incluido el patrón de natación, la posición en la columna de agua y los patrones respiratorios. La información adicional sobre el peso y la longitud promedio del stock, las prácticas de manejo (transporte reciente o anterior, clasificación o tratamientos), así como la respuesta de alimentación, son factores importantes que normalmente están disponibles con los peces de cultivo. Para los peces salvajes, también se debe recolectar la mayor cantidad de información posible y en ambos escenarios, la temperatura del agua y las características químicas y físicas deben registrarse con notas de cualquier evento concurrente o reciente que afecte a otras especies acuáticas o terrestres en el área. En comparación con los animales terrestres, existen pruebas de laboratorio limitadas aplicables a los peces vivos y, por lo tanto, en general, el diagnóstico clínico no es suficiente para un diagnóstico concluyente. Esto enfatiza la necesidad del examen post mortem como un paso esencial hacia el diagnóstico de enfermedades en peces. La descripción proporcionada en este capítulo describe los procedimientos de necropsia con referencia particular a la obtención de muestras adecuadas de los tejidos más comunes recolectados para el examen histológico. Se entiende que durante

la necropsia, también se tomarán otras muestras, p. para microbiológicos análisis, así como muestras de sangre o tejidos para inmunología, estudios serológicos o moleculares. 3.2 Tamaño de muestra y eutanasia El número de peces muestreados para una evaluación de salud variará según los objetivos del estudio. Por ejemplo, la certificación de la libertad de una enfermedad de declaración obligatoria generalmente sigue las pautas de la Oficina Internacional de Epizootias (OIE). Aquí el tamaño de la muestra se basa en una prevalencia asumida del patógeno específico a un nivel acordado de confianza. Para obtener una probabilidad del 9598% de detectar al menos un pez infectado en una población clínicamente sana, esto se traduce en un mínimo de 30 individuos. Por el contrario, para las investigaciones de enfermedades, 5–10 peces que muestran un comportamiento anormal o los signos característicos de la afección serán adecuados para la necropsia. Los peces extraídos para su examen deben, cuando sea práctico, colocarse en un recipiente más pequeño donde se puedan realizar más observaciones antes de cualquier procedimiento o la extracción de tejidos o fluidos corporales. El pescado debe sacrificarse por un método humano, idealmente a través de una sobredosis de anestésico y mantenerse a temperaturas frescas durante la necropsia. 3.3 Procedimiento de necropsia 3.3.1 Examen externo Los peces deben colocarse en una superficie que evite una mayor contaminación para ayudar al examinador a realizar el trabajo. Una bandeja de acero es ideal debido a la contención, facilidad de desinfección y durabilidad. Normalmente, los peces se colocan en el flanco derecho con la cabeza hacia la izquierda, una convención basada en peces fusiformes como los salmónidos, donde los órganos internos se vuelven fácilmente observables y de fácil acceso desde el flanco izquierdo, por lo que se requiere un desplazamiento mínimo de los órganos para observar o acceder a otras estructuras. El pez debe examinarse en un ambiente fresco y tomarse notas del caso durante todo el proceso del examen post mortem, y observar cualquier desviación de la normalidad para la especie. La provisión de una referencia a la posición relativa de la anormalidad o la muestra

tomada es una parte esencial del informe; En la figura 3.1 se resumen algunos términos anatómicos útiles de ubicación aplicables a animales enteros, tejidos o secciones histológicas.

Fig. 3.1 Planos de orientación

Para los peces de menos de 2,0 cm de longitud, se pueden examinar con un microscopio de disección y, cuando sea necesario, se pueden tomar muestras de piel y frotis

de mucosas o branquiales para su análisis inmediato. Sin embargo, para el examen histológico, los peces de este pequeño tamaño pueden conservarse enteros, siempre que se haya abierto o eliminado un colgajo abdominal, una práctica que permite que el fijador penetre dentro de la cavidad del cuerpo y garantice una fijación adecuada. Para peces más grandes, también se pueden tomar muestras frescas de tejidos o fluidos corporales para el análisis inicial in situ, pero para el examen histológico los tejidos deben disecarse con bisturí, tijeras y pinzas. Las branquias son un tejido delicado que requiere un examen rápido, ya que una vez expuestos al aire, los cambios ocurren rápidamente y se secan rápidamente. Las branquias están protegidas por el opérculo, que debe levantarse, con la ayuda de unas pinzas y, en ocasiones, puede ser necesario cortarlas para facilitar el acceso a los arcos branquiales. Se lleva a cabo una inspección para detectar evidencia de anemia, aumento de la mucosa, coágulos sanguíneos o infección parasitaria de los filamentos branquiales o el arco. Se debe extraer una muestra de todo el primer o segundo arco (de peces relativamente pequeños), o una porción (generalmente a nivel curvo) de branquias (ver Fig. 2.2) de peces más grandes. Para esto, el arco se puede sostener con unas pinzas agarrando el arco branquial en un lugar que no formará parte de la muestra y cortando cuidadosamente la porción que se fijará con bisturí o tijeras. Se debe prestar especial atención para evitar cualquier compresión de los filamentos. El tejido debe colocarse rápidamente en el fijador. El pseudobranquio, ubicado en la superficie interna del opérculo, es un tejido objetivo en el salmón para el parásito Myxozoa Parvicapsula spp. y debe ser verificado y muestreado si es necesario. Debe realizarse un control exhaustivo de toda la superficie externa del cuerpo observando la integridad de la piel y las aletas, los cambios de pigmentación normal para la especie, moco excesivo, escamas elevadas o perdidas, erosión, úlceras, hemorragia (por ejemplo, petequial), exoftalmia, parásitos, evidencia de deformidad esquelética o atrofia muscular. Como la piel de los peces está en contacto con el entorno externo, es vulnerable al daño de una variedad de fuentes, incluidos los patógenos primarios y oportunistas. Además, factores como la manipulación también contribuirán a la salud de los peces. Durante el examen post mortem, algunas anormalidades serán evidentes, pero otras solo se reconocerán mediante el examen de los tejidos mediante microscopía óptica. Una

muestra de piel debe representar el área o lesión afectada, incluido un borde de tejido normal. Tanto el tegumento como parte de la musculatura subyacente generalmente se incluyen en la muestra de piel. También es aconsejable una muestra de piel estándar "normal" que también incluye músculo rojo y blanco y un área predeterminada generalmente está al nivel de la línea lateral justo debajo de la aleta dorsal. Las diferentes partes de la superficie del pez tienen una estructura particular, p. la piel de la cabeza carece de escamas y, por lo tanto, deben incluirse muestras que representen áreas de interés discretas. Retire con cuidado una pieza pequeña de aproximadamente 1 cm 3 y colóquela inmediatamente en un fijador, como solución salina formal tamponada al 10%. El ojo normalmente se muestreará a continuación para evitar un secado excesivo antes del análisis y si es de interés para el estudio. Para extraer el ojo, diseccione cuidadosamente la piel alrededor del orbi con unas tijeras curvas pequeñas o un bisturí hasta que haya suficiente tejido disponible para sujetar con pinzas. Tire del ojo hacia adelante para exponer los músculos asociados y el nervio óptico y luego libere todo el globo ocular. Examine brevemente para observar la presencia de hemorragia o exudado en la cámara anterior o parásitos visibles. Algunos laboratorios usan Carnoy (fijador compuesto de 60% de etanol, 30% de cloroformo y 10% de ácido acético glacial, 1 gramo de cloruro férrico). en lugar de formalina para la fijación de los ojos. Cuando el interés principal es el examen parasitológico, esto generalmente requerirá una fijación en un 70% de alcohol. Es aconsejable hacer una incisión en el globo ocular para permitir una fijación adecuada. La boca y la cavidad oral deben examinarse registrando la presencia de cualquier posible hemorragia petequial, vesículas, parásitos o anomalías asociadas con estas estructuras. Finalmente, el cráneo debe abrirse para exponer y examinar el cerebro, un órgano relativamente "protegido" de la contaminación dentro del cráneo. El cerebro no se muestrea de forma rutinaria para la evaluación histológica, pero cuando se requiere, se puede realizar en este punto del examen externo o al final de la necropsia, una vez que finaliza el examen interno y siempre que la disección no se haya retrasado mucho. En peces salmónidos de hasta ~ 500 g, las estructuras craneales son lo suficientemente suaves como para poder cortarlas con un bisturí afilado. Sosteniendo la cabeza firmemente con unas pinzas introducidas en la cavidad oral, corte la parte superior de la cabeza con un solo movimiento decisivo en un

plano horizontal a través de la cabeza, justo por encima del nivel de los ojos. Continúe el corte a lo largo del borde superior del operculo y hacia arriba en la musculatura dorsal. La parte superior cortada del cráneo contendrá el cerebro, ya separado de los diez pares de nervios debajo y la conexión con el bulbo raquídeo. Retirar con cuidado y colocar en el fijador. Alternativamente, la "caja" de cartílago que rodea el cerebro se puede fijar in situ durante 24 h antes de realizar el delicado trabajo de extraerlo del cráneo. Ocasionalmente, cuando el corte se realiza demasiado alto, la mitad del cerebro permanece en la porción inferior, sin embargo, el tejido está suficientemente expuesto como para ser fácilmente accesible. Cuando se examinan peces más grandes, la apertura del cráneo requiere un cuchillo afilado y fuerte para realizar el mismo corte. Se debe registrar un registro de manchas de sangre u otra decoloración del líquido cefalorraquídeo o del propio órgano. 3.3.2 Examen interno Para acceder a los órganos internos, se abre la cavidad corporal. Hay varias formas de abordar la disección, sin embargo, la elección debe prevenir o reducir la probabilidad de que el proceso introduzca artefactos, dañe los tejidos, comprima, corte, mueva o desplace los órganos, así como evitar el riesgo de contaminación. La instrucción proporcionada en esta sección es una guía para un examen interno fácil a simple vista de peces de ~> 15 cm y más. Los peces más pequeños también se pueden diseccionar, sin embargo, las herramientas requeridas se deben adaptar y se debe considerar trabajar bajo el microscopio de disección. Uno de los enfoques más comunes es inclinar el pez para que el vientre quede hacia arriba y, con un bisturí, cortar con cuidado una pequeña incisión a través de la piel y los tejidos subyacentes, ya sea ~ 1 a 2 cm delante del istmo, la parte carnosa entre el opérculo debajo de la cabeza. La incisión es para permitir que se introduzca el extremo rombo de las tijeras para abrir a lo largo de la línea ventral media del abdomen que secciona las estructuras más duras que se encuentran en las fajas pectoral y pélvica. El corte no debe comenzar con las tijeras dentro del respiradero ya que esto dañará el intestino posterior y contaminará el resto de los órganos; Por la misma razón, si el corte comienza en el istmo que se aproxima desde la dirección opuesta, no debe ir más allá de ~ 1–2 cm delante del respiradero. A medida que aumenta la experiencia, todos los procedimientos se pueden realizar con un bisturí. Con este corte único, es posible comenzar

el examen interno y el muestreo levantando la aleta con pinzas, pero sin exponer la cavidad, una práctica que se considera que contribuye a la protección de los órganos internos contra la contaminación. En general, se requiere la exposición de la cavidad del cuerpo entero para la evaluación y permite el acceso a los órganos para el muestreo. Un segundo corte para diseccionar y eliminar la pared del cuerpo comienza en el extremo caudal del primero, moviéndose hacia arriba y ligeramente hacia atrás para alcanzar un nivel justo debajo de la línea lateral. A partir de ahí, el corte gira hacia la cabeza casi horizontalmente justo debajo de la línea lateral que llega al opérculo. Levantar la aleta seccionada con pinzas ayudará a guiar el último corte detrás del opérculo, hacia abajo, hacia la región del istmo para diseccionar completamente el flanco del cuerpo (filete). El límite craneal de la cavidad corporal está definido por el tabique transversal, que separa las cavidades peritoneal y pericárdica. Si necesita acceder al corazón al mismo tiempo, continúe anteriormente con el corte ventral un poco más para exponer la cavidad pericárdica y el corazón, solo craneal al tabique transversal. Las notas sobre la apariencia general de la cavidad corporal pueden incluir referencias a la extensión de la grasa corporal, el crecimiento del tejido o los cambios de color, hinchazón, ascitis, adherencias y ausencia de parásitos enquistados. Para el muestreo de tejidos y dependiendo del tamaño del pez, se pueden fijar órganos completos de individuos pequeños (por ejemplo, corazón o todo el tracto gastrointestinal); a la inversa, se deben extraer y fijar porciones de peces más grandes de ~ 1 cm3 de cada órgano. El corazón se diseca levantando la parte craneal de la arteriosidad bulbosa y cortando la conexión a la aorta ventral y sujetando este extremo, tirando suavemente para permitir que el corazón se mueva lo suficientemente hacia adelante para exponer y liberar el seno venoso, conectándose con el venas cardinales y seno hepático. El corazón puede mostrar lesiones que involucran el miocardio y los vasos sanguíneos asociados, incluidos los coágulos de sangre que llenan la cavidad pericárdica (hemopericardio) y, en ocasiones, también se pueden encontrar parásitos en el corazón o alrededor de él. Para una mejor fijación de los corazones grandes, puede ser necesario dividir el órgano longitudinalmente antes de colocarlo en el fijador.

4: Diagnóstico de patología y enfermedad. La patología es el estudio y diagnóstico de la enfermedad, y el reconocimiento e interpretación de los procesos fisiológicos y patológicos. Esto requiere una comprensión profunda de la estructura del tejido normal y la microanatomía. La estructura normal varía ampliamente entre especies, edades y etapas fisiológicas y de desarrollo, e incluso dentro de una población pueden ocurrir variaciones, por lo tanto, es esencial comprender estos cambios y cómo se relacionan con el estado de las especies bajo investigación. Además, muchas enfermedades tienen un aspecto similar a nivel bruto y para ilustrar este aspecto, las imágenes de la piel, los riñones y el hígado que muestran una variedad de lesiones de diferentes causas se presentan en las Figs. 4.1, 4.2 y 4.3. Los tipos de células en los peces son, en principio, los mismos que los que se encuentran en los mamíferos y, de manera similar, muchos estímulos patológicos directos e indirectos inducen cambios patológicos generales en lugar de ser patognomónicos. Las células tienen un repertorio limitado de respuesta morfológica a la lesión y están vinculadas a mecanismos bioquímicos que determinan el resultado de la lesión celular, lo que explica la aparición de células dentro de las lesiones. Un enfoque metódico es un requisito previo para un diagnóstico preciso y esto requiere una descripción de los cambios en los tejidos que ocurren en relación con agentes infecciosos y no infecciosos, respuesta a lesiones agudas o crónicas, desequilibrio nutricional y otras causas de enfermedad o anormalidad, seguido de histopatología Las siguientes áreas se tratarán en este capítulo: inflamación, proliferación, trastornos circulatorios, daño celular y necrosis, pigmentos y mineralización y neoplasia. Finalmente, se proporciona una breve descripción de los artefactos para ayudar a distinguirlos de los cambios patológicos tangibles. 4.1 Inflamación y proliferación Las lesiones pueden clasificarse según su inicio como agudo y crónico. Sin embargo, la patogénesis de una lesión inflamatoria y el aspecto histológico pueden ser similares. Un componente importante de la inflamación aguda implica cambios en las proteínas plasmáticas. Los exudados serosos y fibrinosos son una característica de los tejidos inflamados y consisten histológicamente en una tinción eosinofílica en el espacio intercelular y la presencia de hebras eosinofílicas, respectivamente. Los focos inflamatorios se caracterizan por la exudación que comp...