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Neurophysiologie TD1 - Le patch clamp et les signaux électriques des neurones...

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Neurophysiologie : TD

Le patch clamp et les signaux électriques des neurones Les canaux ioniques :

Canaux de fuite :  Toujours ouverts  Perméable au K+  Perméable à la fois au Na+ et K+ Pompe Na+/K+ :  Hydrolyse de l’ATP en ADP  Maintien du gradient de concentration de Na+ et de K+ Canaux voltage-dépendants :  L’ouverture du canal dépend de Vm

Composition ionique des milieux intra et extracellulaire : La répartition des ions de part et d’autre de la membrane d’un neurone est inégale :  Milieu intracellulaire (mM) : o [Na+] = 14 o [K+] = 140 o [Ca2+] = 10-4 o [Cl-] = 14 o [P-] = 125  Milieu extracellulaire (mM) : o [Na+] = 140 o [K+] = 3 o [Ca2+] = 1 o [Cl-] = 144 o [P-] = 0 Les solutions ioniques à l’intérieur et l’extérieur de la membrane sont électriquement neutres. Le nombre de charge + est égale au nombre de charge -. Il y a électroneutralité. L’existence d’un gradient de concentration d’une espèce ionique de part et d’autre de la membrane entraine l’existence d’un gradient électrique. Chaque espèce ionique tend à diffuser selon son gradient de concentration (du + concentré vers le – concentré). Exemple : flux de K+ 1

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Conséquence du flux de K+ : A devient plus négatif que B. Il y a création d’un champ électrique (force électrostatique) qui va freiner le flux de K  création d’une différence de potentiel

L’équilibre est atteint quand le gradient électrique compense exactement le gradient de concentration. La diffusion d’un soluté dépend de :  Etat du canal : ouvert ou fermé  Force chimique : la différence de concentration de part et d’autre de la membrane  Force électrique : la différence électrique de part et d’autre de la membrane

Force électromotrice globale

Equation de Nernst :

[ ion ]e E ( V )= RT ln( ) zF [ ion ]i    

R : constante des gaz parfaits = 8,314 J.K-1.mol-1 T : température absolue : T(K) = T(°C) + 273,15 z : électrovalence de l’ion F : constante de Faraday = 96500 C.mol-1

On définit un potentiel membranaire d’équilibre pour chaque ion (Eion) par l’équation de Nernst. Pour cette valeur le flux net est nul :

Eion =2,303

( )

[ion ]e RT log ZF [ion ]i

[ionique] mM [K] [Na] [Cl] [Ca]

Milieu intra 140 14 14 10-4

Milieu extra 3 140 144 1

Lorsqu’un canal est perméable à 2 ions :

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Eion (20°c) -96 mV + 58 mV - 58 mV + 116

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Eion =2,303

[ ion 1 ]e + [ ion 2 ]e RT ) log( [ ion 1 ]i+ [ ion 2 ]i ZF

A 20°C, pour un canal Na/K :

140 + 3 =−0,9 mV ( 140 + 14 )

E=29.10−3 log

Gradient électrochimique – courant ionique : Gradient électrochimique est la différence entre le potentiel de membrane et le potentiel d’équilibre de l’ion : Vm – Eion Ions Eion mV [K] (- 96) [Na] + 58 [Cl] (-58) [Ca] + 116   

Le potentiel de membrane (Vm) d’une cellule varie entre -40 mV et -60mV. V est différent de E (K,Na, Ca)  aucun ion en équilibre (exception Cl) V – Eion différent de 0.

Gradient électrochimique = flux net d’une espèce chimique Jion :

J ion =V −Eion Par convention :  Flux positif : cation a tendance à sortir (K)  Flux négatif : cation a tendance à entrer (Na, Ca) La conductance électrique (gammaion) définie la facilité avec laquelle le courant se déplace entre deux points. La conductance s’exprime en semens (S) et est l’inverse de la résistance rion exprimée en ohm (Ω) :

1 γ ion= r ion Par convention :  γ ion est la conductance du canal 

gion est la conductance de toute la membrane de la cellule

gion est proportionnelle à γ ion mais aussi à :  Nion le nombre total de canaux de l’espèce ionique dans la membrane  P0 la probabilité de présence à l’état ouvert des canaux

gion =γ ion x N ion x P0 Transposition de la loi d’Ohm à un gradient électrochimique : Courant unitaire : iion=γ ion (V −E ion) Loi d’Ohm : V = R.i V : imposé (volt) R : calculé (ohms) I : mesuré (ampère) Pour une cellule entière, le courant transmembranaire (Iion) transporté par une espèce ionique à travers tous les canaux ioniques de la membrane d’une cellule est égale à : 3

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I ion =gion (V −E ion) I ion =γ ion x N ion x P0 (V −E ion ) I ion =i ion x N ion x P 0 → couran t ionique globale Que se passe t-il quand la membrane de la cellule est perméable à différents ions ? Les cellules sont perméables à plusieurs ions : K, Na, Cl et Ca. Le potentiel de membrane se stabilise quand le flux de tous les ions à travers les différents canaux est nul. A l’état stationnaire : I Na + I K + I Cl + I Ca =0 D’où :

I K =g K (V −E K ) I Na =g Na (V −E Na ) I Cl =gCl (V −E Cl ) I Ca =gCa (V −ECa ) Flux d’ion à travers la membrane cellulaire avec V = - 60 mV

I Ca =I Cl=0 I Na + I K =0 I K =g K (V −E K )

Avec

I Na =g Na (V −E Na ) V=

g K E K +g Na E Na g K + g Na

V=

α E Na +E K 1+α

Dans la majorité des cellules, il y a beaucoup plus de canaux K que de canaux Na ouverts.

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Méthode d’étude en électrophysiologie Courant imposé (current clamp) C’est la première mesure développée. Il s’agit de l’injection d’un courant et de la mesure des variations de potentiel de membrane. Cette technique est utilisée pour étudier comment une cellule répond lors d’une entrée de courant.  importance pour la compréhension de la réponse des neurones aux neurotransmetteurs (acétylcholine).

Voltage imposé (voltage clamp) Il s’agit du maintien du potentiel de membrane à une valeur donnée et l’enregistrement d’un courant traversant la membrane.  mesure du courant macroscopique

Voltage imposé – courant imposé

Dépolarisation

Hyperpolarisation

Courant imposé Le flux ionique conduit à une augmentation de charge + du côté intracellulaire (ex : entrée de Na ou sortie de Cl). Le flux ionique conduit à une augmentation de charge – dans la cellule (ex : sortie de K ou entrée de Cl).

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Voltage imposé Un courant entrant. Ce courant va vers le bas.

Un courant sortant. Ce courant va vers le haut.

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La technique de patch-clamp C’est une variation du voltage imposé. Il s’agit d’une technique de mesure d’un courant ionique à travers une portion de la membrane (quelques canaux, voire un seul). On va mesurer soit un courant élémentaire (unitaire) ou un courant macroscopique (global).

Le patch-clamp : comment ça marche ? La pipette de verre remplie d’une solution conductrice est pressée contre la surface d’une membrane cellulaire contenant des canaux ioniques. La pipette est connectée à un amplificateur : électrode d’enregistrement. La membrane est préalablement traitée aux protéases pour enlever la matrice extracellulaire la rendant lisse.

Loi d’Ohm :

V =R x i   

V imposé : volt R calculé : ohms i mesuré : ampère

Réalisation d’un scellement sur la membrane plasmique Aspiration d’une partie de la membrane : création d’une zone oméga. Etanchéité parfaite  la résistance entre l’intérieur de la pipette et le milieu extracellulaire est excessivement forte (de 10 à 100 gigaOhm). La haute résistance permet d’avoir une stabilité d’enregistrement en isolant électroniquement et réduit le bruit de fond. Les petits changements en résistance provoqués par l’ouverture et la fermeture des canaux dans la membrane peuvent être détectés grâce à un système d’amplificateur.

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Les configurations du patch-clamp Techniques de patch entier  le patch est attaché à la cellule (conformation cell attached, whole cell) Technique de patch excisé  le patch est détaché de la cellule (conformation inside out et outside out) Tout dépend de ce qu’on veut étudier !

Cellule attachée (cell attachez patch) But : étudier les propriétés d’un canal ionique ou d’un récepteur dans les conditions physiologiques (sans perturber le milieu intracellulaire).  Pipette collée à la membrane pour obtenir le sel  La membrane plasmique reste intacte  Enregistrement des courants traversant un ou plusieurs canaux ioniques  courant unitaire  Pour les canaux à ligands : le neurotransmetteur est inclus dans la solution de la pipette afin qu’il interagisse avec la surface externe de la membrane Avantages Milieu interne de la cellule conservé Méthode non invasive

Inconvénients Milieu interne de la cellule non contrôlé

Cellule entière (whole cell patch) But : étudier l’activité électrophysiologique de l’ensemble des canaux et des récepteurs au niveau d’une cellule entière.  On applique plus d’aspiration pour rompre la membrane emprisonnée à l’intérieur de la pipette  Accès de la pipette à l’espace intracellulaire  Enregistrement des courants de plusieurs canaux simultanément  courant global  Cette technique est moins traumatisante que l’introduction d’une électrode de mesure dans le cas du voltage imposé Avantage Milieu externe/interne bien contrôlés On enregistre les courants de toute la cellule (environ 10-9 A)

Inconvénient Mélange des milieux intrapipette et intracellulaire  Possibilité d’altération des propriétés

Inside out patch But : étudier la régulation de l’activité d’un canal ou d’un récepteur par des enzymes, 2nd messagers etc… Cela donne une idée de la régulation intracellulaire de l’activité des canaux.  Une partie de la membrane est attachée à la pipette et détachée du reste de la cellule

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   

La face interne est exposée au bain « inside out » On a accès à l’intérieur de la cellule  utile quand on veut manipuler l’environnement à la surface interne des canaux ioniques Mesure du courant unitaire du canal piégé dans le fragment de la membrane Exemple : étude des canaux activés par des ligands intracellulaires par gamme de concentration

Avantage Milieu interne parfaitement contrôlé

Inconvénient Perte d’éventuels facteurs de régulation du canal

Outside out patch But : étudier les propriétés d’un récepteur canal et déterminer particulièrement l’affinité du récepteur pour un agoniste.  Contrairement au « inside out », la face externe de la membrane est exposée au bain « outside out »  Permet d’examiner les propriétés d’un canal ionique isolé de la cellule et exposé à différentes solutions à sa face externe  Exemple : étude des canaux activés par des neurotransmetteurs provenant de l’extérieur par gamme de concentration Avantage Milieu externe parfaitement contrôlé

Inconvénient Perte d’éventuels facteurs de régulation du canal Assez difficile à obtenir en pratique

Les configurations du patch clamp

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Signal de sortie : sens conventionnel Par convention le sens du courant se réfère au sens du mouvement des charges +. Une entrée de cations est un courant négatif (vers le bas, - X pA) : courant entrant  Ce courant est à l’origine d’une dépolarisation (+ Y mV) Une sortie de cations est un courant positif (vers le haut, + X pA) : courant sortant  Ce courant est à l’origine d’une hyperpolarisation (-Y mV)

Cellule et électrode de mesure : un courant entrant dans la cellule est un courant entrant dans l’electrode (cf. après).

Enregistrement en canal unitaire (cell-attached, inside/outside out)

Un seul créneau de courant  un seul canal actif sous la pointe de la pipette.

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3 crénaux de courant de même amplitude  3 canaux identique (diapo 37).

Enregistrements de courant macroscopiques (whole cell)

Cellule entière  N canaux du même type  courant ionique global :

I global =iunitaire x N ion x P 0

Probabilité d’ouverture : P0 =

Durée à l ' état ouvert Durée à l ' état ouvert = Durée à l ' état ouvert + durée à l ' état fermé Durée totale de stimulation

La conductance d’un canal La pente de la courbe correspond à la conductance unitaire. Solution identiques des deux côtés.

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Détermination de la sélectivité ionique du canal

Le potentiel d’inversion du canal se déplace vers le potentiel d’équilibre de l’ion le plus perméant (E K = + 60mV ; ECl = -60 mV)  C’est un canal K.

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