Patch-Clamp - Notes de cours 2 PDF

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Cours 2 Physiologie PACES Pr. Guihard...

Description

La technique de Patch-Clamp Technique dédiée à l’étude des canaux. On regarde les cellules par en dessous, avec un microscope inversé. On utilise une micropipette du verre, à manipuler avec précaution car il faut la poser sur une cellule —> contact physique verre/phospholipides. Il y a une forte affinité donc ils vont se coller. A partir de là on définit 4 formations de patch-clamp : cellule attachée (si on a de la chance on va voir un ou quelques canaux individuels. Si on arrache un bout de membrane qui reste collé à la pointe de la pipette, c’est la configuration inside-out (un ou quelques canaux). Ensuite on a la configuration cellule entière. On aspire avec la micro-pipette —> création d’une dépression importante —> on aspire un patch

(bout de membrane) —> on crée une continuité entre la pipette et la cellule et on peut donc accéder à l’ensemble des canaux de la cellule (populations de canaux). La dernière est l’outside-out, on l’atteint en déplaçant la pipette par rapport à la cellule — > revascularisation à la pointe de la pipette (un à quelques canaux). Des canaux ont la capacité à générer des flux passifs qui dépendent de la différence de concentration, la perméabilité vis à vis de l’ion (qui peut varier). Si on peut mesurer la perméabilité on peut avoir une idée du flux malheureusement c’est très difficile d mesurer des flux avec une bonne résolution dans le temps. Mais on sait mesurer J en le transformant en autre chose car il existe une correspondance physique entre J et I (courant et flux).

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On transforme un flux ionique en courant ionique. Donc en gros le patch-clamp est un ampèremètre. On suit la loi d’ohm. Tout l’enjeu de la Patch-Clamp c’est de mesurer une conductance G et d’en déduire les propriétés des canaux. S’il y a des canaux, quand on les amène à -80, ils ne s’activent pas car il n’y a pas de canaux. Le courant INa a sûrement un. Si je stimule de -90 à +70, on voit un grand courant qui s’active puis s’inactive mais dans le sens sortant. On va pouvoir à ce moment là tracer de courbes courant/potentiel. Le courant est toujours placé en ordonnée (courant positif sortant vers le haut et courant négatif entrant vers le bas). A chaque fois qu’on a imposé Em on a choisi I. Si la représentation graphique I sur Em est une droite on a à fair à un courant ohmique donc quelle que soit la valeur de Em alors G est constante. Certains vont être plus ou moins sortants qu’un courant ohmique. Un courant plus

sortant présente une rectification sortante et moins sortant, il présente une rectification entrante. G n’est pas constante. On peut avoir des courants plus entrants qui ont une rectification sortante, et des courants moins sortants qui ont une rectification entrante. Tous les courants ioniques obéissent à la loi d’Ohm. Certains uniquement à cette loi donc ce sont des courants Ohmiques (G constante en fonction de Em). D’autres courants obéissent un peu moins strictement à la loi d’Ohm, ils sont alors rectifiants (dans le sens entrant ou sortant). La conductance G n’est alors plus constante sur l’échelle des valeurs de Em imposée. Em - Exemple c’est la force électromotrice, celle qui pousse les ions dan Sun sens ou dans l’autre. I c’est le flux de charges qui accompagne le flux des ions. G c’est l’activité des populations des canaux. Une conductance reflète l’activité des protéines qui

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conduisent les charges (ici uniquement les canaux ioniques). Être capable de mesurer G et d’en mesurer les variations c’est comprendre les propriétés des canaux.

IK1 : GK1 : En présence de magnésium, le courant devient mois sortant qu’il ne devrait l’être. Il est responsable d’une rectification entrante. IKdr : En dessous d’une certaine valeur de Em, on a pas d’intensité donc les canaux ne sont pas ouverts. Au delà on a une intensité donc les canaux sont activés, cette valeur est donc une valeur seuil. GKdr : Rectification qui dépend du voltage, G varie en fonction de Em, c’est le signe d’une voltage dépendance. INa : En dessous du seuil d’activation les canaux sont fermés. On passe par un maximum alors que Em devient de moins en moins négatif puis on a une relation linéaire. GNa : En deçà du seuil d’activation, pas de courant donc pas de conductance. Au delà, GNa augmente selon une courbe sigmoïde en fonction de Em —> il existe une valeur de conductance maximale donc l’activité des canaux NaV tend vers une activité maximale, augmenter Em ne changera pas l’activité des canaux. La voltage dépendance est une caractéristique démontrable, il faut montrer que la

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conductance, donc l’activité du canal dépend de la valeur de Em. 3 configurations permettent d’observer un seul et unique canal. Le courant généré par un seul et unique canal est en général de l’ordre de 10 -12 A. Un canal n’a que deux états : fermé et ouvert. On ne peut pas observer la cinétique du changement d’état, c’est trop rapide donc on dit que la transition est instantanée. G c’est l’activité, γ c’est la conductance d’un seul canal et Po c’est la probabilité d’ouverture d’un seul canal.

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